CD59基因W40位點突變、真核表達與生物學活性研究.pdf

1、目的:采用基因點突變技術(shù)構(gòu)建兩種CD59突變基因并重組入真核表達質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立高效真核表達系統(tǒng)，觀測細胞表面野生型CD59與突變型CD59分子的表達情況，探討CD59抗補體活性變化，推斷W40位點及鄰近氨基酸的生物學活性，以初步揭示CD59分子在腫瘤逃逸中的作用，為腫瘤免疫治療提供理論依據(jù)。 方法:選取物種問高度保守W40位點基因及相鄰堿基為突變位點，構(gòu)建兩種不同的基因突變，一種是編碼W40的密碼子TGG缺失突變(M1

2、)，另一種是C39W40K41→W39W40W41的相應基因突變(M2)，采用Overlap extension PCR法誘導CD59點突變，各設(shè)計兩條常規(guī)引物和兩條反向互補突變引物，以己構(gòu)建CD59cDNA為模板，3重PCR定點誘變擴增突變基因，重組入克隆載體PMDl8-T-Vector,EcoRⅠ單酶切后，突變基因重組入真核表達載體pIRES。利用陽離子脂質(zhì)體(Lipfectamine2000)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細胞(Chi

3、nese hamster ovary,CHO)進行表達。G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞克隆，核酸原位雜交檢測CD59mRNA的表達，熒光免疫組化、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和免疫印跡技術(shù)檢測篩選CD59突變基因蛋白高表達株，染料釋放試驗與臺盼藍染色試驗檢測和比較野生型與突變型CD59蛋白抗補體活性的不同。 結(jié)果:通過PCR定點誘變成功獲得目的CD59突變基因，序列測定及酶切鑒定均證實成功構(gòu)建了pIRES-M1CD59、pIRES-

4、M2CD59重組真核表達載體系統(tǒng)，突變基因長度約500bp。核酸原位雜交顯示CD59mRNA的表達，免疫熒光、ELISA、Western-blot驗證CD59的表達，傳代30代，仍可測到蛋白表達；熒光染料釋放試驗和臺盼藍染色試驗研究顯示與野生型CD59相比，突變型M1CD59失去對補體的抑制功能，而突變型M2CD59對補體的抑制作用較強。 結(jié)論： 1.采用基因點突變和基因重組技術(shù)成功構(gòu)建兩種突變CD59重組質(zhì)粒。