CD147與CAML在惡性黑素瘤細(xì)胞中的相互作用研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、研究目的:
  CD147是一種屬于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白,本實驗組前期研究表明CD147能促進惡性黑素瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖和血管新生,但具體機制還不十分清楚。鈣離子信號調(diào)節(jié)親環(huán)素配體(calcium-modulatingcyclophilinligand,CAML)是定位于線粒體的跨膜蛋白,能調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子濃度,本研究擬通過對CD147與CAML在惡性黑素瘤細(xì)胞株A375中相互作用的研究,明確其相互作用的位點,在細(xì)胞中的定位

2、及對胞內(nèi)鈣離子的影響,為進一步揭示惡性黑素瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制提供理論依據(jù)。
  研究方法:
  1.以CD147為誘餌,運用酵母雙雜交技術(shù)篩選人胚腦細(xì)胞文庫,以尋求與其相互作用的蛋白。
  2.構(gòu)建CAML與CD147全長及缺失突變體的真核表達載體。
  3.運用免疫共沉淀(co-IP)驗證CD147與CAML相互結(jié)合,同時共轉(zhuǎn)染CAML質(zhì)粒及CD147的不同缺失突變體質(zhì)粒至工具細(xì)胞293T,co-IP分析CD

3、147與CAML相互結(jié)合的位點。
  4.運用細(xì)胞免疫熒光方法觀察A375細(xì)胞中CD147與CAML的定位,同時在A375細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染CAML及CD147的不同缺失突變體質(zhì)粒,檢測不同區(qū)段對定位的影響。
  5.合成CD147的小分子干擾RNA(smallinterferingRNA,iRNA)片段,利用該片段在A375細(xì)胞中敲降CD147并檢測敲降效率。
  6.運用Fluo-4,AM探針觀察CD147敲降對A375

4、細(xì)胞內(nèi)靜息鈣離子濃度的影響,以及毒胡蘿卜素(thapsigargin,TG)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子ATP酶(Sarco/EndoplasmicreticulumCa2+-ATPase,SERCA)后對胞內(nèi)鈣離子流動的影響。
  7.運用佛波酯(phorbol12-myristate13-acetate,PMA)和TG上升A375細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子,檢測基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinase9,MMP-9)的表達水平

5、,同時檢測CD147敲降的A375細(xì)胞在上述兩種藥物作用后的MMP-9表達水平的變化。
  研究結(jié)果:
  1.酵母雙雜交篩選出CAML與CD147相互作用。
  2.成功構(gòu)建了CAML與CD147全長及缺失突變體的真核表達載體。
  3.Co-IP驗證CAML與CD147相互作用的結(jié)果,并進一步證實CD147與CAML相互結(jié)合的區(qū)段位于CD147跨膜段。
  4.細(xì)胞免疫熒光發(fā)現(xiàn)A375細(xì)胞中CD147與

6、CAML在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在共定位現(xiàn)象,缺失跨膜及膜內(nèi)段的CD147突變體與CAML幾乎不存在共定位。
  5.成功設(shè)計并應(yīng)用兩個CD147siRNA片段,以無特異性siRNA序列為對照組。
  6.CD147敲降的A375細(xì)胞內(nèi)靜息鈣離子濃度及TG刺激胞漿內(nèi)鈣離子上升幅度均低于對照組。
  7.PMA及TG上升胞內(nèi)鈣離子后能誘導(dǎo)MMP-9的表達增加,而敲降CD147則能顯著抑制鈣離子對MMP-9的誘導(dǎo)效應(yīng)。
  結(jié)論:

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