CD163及其它蛋白在PRRSV感染細(xì)胞過程中的相互作用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征又名“藍(lán)耳病”。是由PRRS病毒感染所致的一種接觸性傳染病。該病以繁殖障礙、呼吸道疾病、哺乳仔豬的高死亡率、免疫抑制和持續(xù)性感染等為主要特征。其病原具有典型的嗜單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞特性，在體內(nèi)，PRRSV主要感染豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)，在體外，主要感染非洲綠猴腎細(xì)胞系MA-104及其衍生物Marc-145。PRRSV感染宿主細(xì)胞首先通過與細(xì)胞膜表面上的特異受體結(jié)合，利用細(xì)胞的內(nèi)吞作用而感染易感細(xì)胞。至今，已報(bào)道了四個(gè)獨(dú)

2、立但功能相關(guān)的PRRSV細(xì)胞受體。唾液酸粘附素(Sialoadhesin，Sn)、似肝磷脂蛋白(Heparan sulphate,HS),波形蛋白(Vimentin)和清道夫受體(CD 163)。研究發(fā)現(xiàn)HS主要作用是吸附PRRSV到PAM細(xì)胞上，Sn則介導(dǎo)病毒的內(nèi)吞，CD163可能協(xié)助Sn內(nèi)吞，病毒脫衣殼和將基因組RNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中的作用。導(dǎo)師周恩民教授通過免疫共沉淀用單克隆抗獨(dú)特型抗體Mab2-5 G2(Mab2-5 G2:針對(duì)抗

3、GP5抗體)在豬肺泡巨噬細(xì)胞和Marc-145中提取到一個(gè)分子量約為230kD的蛋白質(zhì)，可能是PRRSV的一個(gè)新的受體，經(jīng)質(zhì)譜分析和測序確定為非肌肉肌球蛋白ⅡA (Non-myscle myosin ⅡA，NMHC ⅡA)。在動(dòng)物體內(nèi)，非肌肉肌球蛋白Ⅱ有三種異構(gòu)體:ⅡA,ⅡB,ⅡC。此蛋白廣泛分布在整個(gè)生物體內(nèi)，在細(xì)胞的吸附，遷移和胞質(zhì)分裂中發(fā)揮重要的作用。
　　 為確定CD163受體在PRRS病毒侵染過程中的作用以及與非肌肉肌

4、球蛋白之間的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)分別從豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)和非洲綠猴腎細(xì)胞(Marc-145)中經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出編碼CD163受體的全長基因，并克隆到pcDNA3.1/VS-His A載體中，得到表達(dá)CD163受體的真核表達(dá)載體。豬腎PK-15細(xì)胞和幼倉鼠腎細(xì)胞BHK-21為PRRSV非易感細(xì)胞系，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染PK-15和BHK-21細(xì)胞后接種PRRSV，然后利用PRRSV的核衣殼蛋白(Nucleocapsid，N)的單克隆抗體進(jìn)行間

5、接免疫熒光檢測病毒的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)CD 163蛋白的PK-15細(xì)胞/BHK-21細(xì)胞能夠感染PRRSV。并且發(fā)現(xiàn)，CD 163在PK-15和BHK-21細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率是有很大差別的，CD 163在BHK-21中的轉(zhuǎn)染效率約為10％，而在PK-15中的轉(zhuǎn)染效率約為30％。在此基礎(chǔ)上，共轉(zhuǎn)染全長的CD 163和真核表達(dá)的非肌肉肌球蛋白ⅡA羧基端330AA的蛋白PRA于非易感細(xì)胞系BHK-21,按100TCID50接PRRSV-12＃，

6、通過間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)病毒感染量增加。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CD 163和PRA在PRRSV感染過程中可能起協(xié)同作用;為了證明NMHC ⅡA與PRRSV的關(guān)系，Marc-145細(xì)胞被PRRSV感染，并在不同時(shí)間內(nèi)固定，通過共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)，PRRSV在4 ℃時(shí)，主要吸附在細(xì)胞的表面，轉(zhuǎn)入37℃后，大約5min，開始進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，隨著時(shí)間的延長，病毒進(jìn)入細(xì)胞，則發(fā)現(xiàn)NMHCⅡA的表達(dá)量增多，在60min時(shí)PRRSV完全進(jìn)入細(xì)胞，NMHCⅡA的

7、表達(dá)量也開始減少。上述實(shí)驗(yàn)揭示，NMHCⅡA可能與PRRSV感染細(xì)胞有關(guān)。
　　 使用Scanprosite軟件分別對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)和Marc-145細(xì)胞的CD 163蛋白結(jié)構(gòu)和功能域進(jìn)行預(yù)測。CD 163有1個(gè)信號(hào)肽和9個(gè)SRCR結(jié)構(gòu)域(Scavengerreceptor cystein-rich domain)，在SRCR 6和 SRCR 7之間有一個(gè)富含脯氨酸-絲氨酸-蘇氨酸(proline-serine-thr

8、eonine，PST)區(qū)域。第二個(gè)PST區(qū)域則與SRCR 9相連。在CD 163的羧基端含有一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)短的胞質(zhì)尾部。對(duì)于PAM，全長的CD 163有1115個(gè)氨基酸組成，SRCR 1-9在CD 163中的位置分別是54AA-151AA， 161AA-258AA,268AA-365AA,375 AA-472AA,480AA-577AA，585AA-682AA,721AA-818AA,828AA-925AA，931AA-1028AA;

9、第一個(gè)PST區(qū)域所在的位置是683AA-720AA;第二個(gè)PST以及胞質(zhì)尾部在1029AA-1115 AA之間。對(duì)于Marc-145細(xì)胞的CD163，還沒有人報(bào)道其全長序列，根據(jù)Vero細(xì)胞和PAM的CD 163核苷酸序列的高度同源性，設(shè)計(jì)引物，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出其全長序列是1117個(gè)氨基酸，首次在GenBank上注冊(cè)，其基因序列號(hào)是JF753553。其SRCR1-9在CD 163中的位置分別是54AA-152AA，162AA-259

10、AA,269AA-366AA,376AA-473AA,481AA-578AA，5 86AA-683 AA,722AA-819AA， 831AA-926AA， 932AA-1029AA。第一個(gè)PST位置是684AA-721 AA;第二個(gè)PST以及胞質(zhì)尾部在1030AA-1116AA之間。通過SignalP信號(hào)預(yù)測軟件預(yù)測知CD 163氨基端1-16個(gè)核苷酸是信號(hào)肽，它指導(dǎo)著CD 163的跨膜轉(zhuǎn)移。
　　 根據(jù)CD 163基因的結(jié)構(gòu)

11、特征以及相關(guān)的文獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步將PAM和M arc-145細(xì)胞中的CD 163受體基因各分割成3段。根據(jù)其來源不同將PAM中的CD 163片段命名為P1,P2,P3;Marc-145細(xì)胞中的CD 163片段命名為M1,M2,M3。經(jīng)RT-PCR將各個(gè)片段克隆到PMD 18-T載體，并將各個(gè)片段分別構(gòu)建于真核表達(dá)載體pcDNA3.1/v5-His A和 pEGFP-N1中。命名為Z-P1，Z-P2,Z-P3;Z-M1,Z-M2,Z-M3

12、。Z-P1(798bp)，在全長中的位置1-798bp；Z-P2在790bp-2046bp之間，共1257bp；Z-P3是2023bp-3345bp (1323bp);Z-M1含有777bp從1bp-777bp；M-2則從763bp-2049bp,共為1287bp;M3是1317bp，從CD 163全長的2035bp到3351bp。分別將它們轉(zhuǎn)染非易感細(xì)胞系BHK-21和PK-15，并對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)P3和M3轉(zhuǎn)染效率最高，

13、P2,M2次之，P1,M1最低。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)短片段的CD 163在BHK-21細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率比在PK-15中的高。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接入PRRSV后，通過PRRSV的N蛋白單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染P1，M1的非易感細(xì)胞并不被PRRSV感染，而P2，M2和P3，M3則能夠被病毒感染，并且發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染P2，M2的非易感細(xì)胞病毒感染量要強(qiáng)于P3，M3。說明CD 163的SRCR1-2并不參與病毒的感染，SRCR4-6對(duì)PRRSV復(fù)制起主要作用。
　　

14、 為了進(jìn)一步研究CD 163在病毒感染中的作用以及PRRSV受體與受體、受體與PRRSV的蛋白、受體與非肌肉肌球蛋白(ⅡA,ⅡB)之間的關(guān)系，將分段的CD 163片段進(jìn)行原核表達(dá)。通過稀有密碼子Graphical codon analysis分析軟件，發(fā)現(xiàn)CD 163序列中含有很多的稀有密碼子，不利于蛋白的表達(dá)，為了蛋白表達(dá)，將P1,M1,P3，M3基因進(jìn)一步的截短，截短的基因分別命名為Y-P1,Y-M1,Y-P3,Y-M3。其大小分別

15、變?yōu)?39bp，618bp，942bp和978bp，在CD163中的原位置依次變?yōu)?60bp-798bp,160bp-777bp,2143bp-3084bp和 2143bp-3120bp。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28a-Y(P1,P2,P3,M1,M2,M3)測序檢測沒有移碼和突變，轉(zhuǎn)入Rosetta感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE分析，表達(dá)的重組蛋白大小分別約為24KD,46KD,35KD,22KD,46KD和36kD，與

16、預(yù)期的結(jié)果相吻合。經(jīng)Western-blot檢測，所獲得的各段重組蛋白均能與抗His-單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。將純化的重組蛋白分別免疫Balb/c小鼠，二免后，獲得高免的小鼠血清。根據(jù)血清病毒阻斷實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Y-P3和Y-M3小鼠血清在1/20和1/40的時(shí)候，能夠阻斷病毒感染，而Y-P2和Y-M2不僅沒有阻斷反而稍微增強(qiáng)，而Y-P1和Y-P2則與對(duì)照沒有明顯的區(qū)別;蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)純化復(fù)性的CD 163片段能夠與Marc-145結(jié)合

17、，通過熒光強(qiáng)度和細(xì)胞數(shù)量，證明在200μg/ml的條件下P1和M3結(jié)合最弱。蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明CD 163各片段可能結(jié)合Marc-145細(xì)胞上的某蛋白;為了證明CD 163片段與NMHCⅡA的關(guān)系，通過免疫共沉淀技術(shù)以及Western Blot實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)M1和M3能夠結(jié)合NMHC ⅡA;在原核表達(dá)水平上，通過ELISA實(shí)驗(yàn)，證明GP5蛋白不與CD 163各個(gè)片段相互作用，而當(dāng)將GP5的幾個(gè)抗原表位(GP5-1,GP5-2,GP5-3,Gp

18、5-4)分段表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)GP5-1與P1,P3和M1存在著一定的相互作用;GP_5-2與P1,P3,M1有相互作用;GP5-4則與P1,M1;而GP5-3則與CD 163各片段不存在相互作用。唾液酸粘附素Sn的分段蛋白Sn-1，Sn-3分別與CD 163各個(gè)片段進(jìn)行孵育，發(fā)現(xiàn)Sn-1與P1,M1,M3存在著相互作用，而Sn-3則與M1和M3有一定的相互作用。同時(shí)，還證明PRA與P3，M1相互作用，而PRB(非肌肉肌球蛋白ⅡB羧基端267