ADAM17介導(dǎo)的CD163表達(dá)調(diào)控對(duì)PRRSV感染的影響.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病之一。根據(jù)核酸序列的差異，PRRSV被劃分為歐洲型和美洲型毒株。2006年5月以來(lái)，我國(guó)暴發(fā)的被稱為“高熱綜合癥”的豬病，即為變異的美洲型高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV）所致。
　　豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)是PRRSV入侵豬體

2、的靶細(xì)胞，已發(fā)現(xiàn)在PAM上存在三種主要的PRRSV細(xì)胞受體:硫酸乙酰肝素(HS)、唾液酸粘附素(Sn)和清道夫受體CD163。HS的作用是吸附PRRSV到細(xì)胞表面，Sn可以加強(qiáng)吸附作用并介導(dǎo)PRRSV內(nèi)吞進(jìn)入胞內(nèi)，CD163則是隨PRRSV一同進(jìn)入胞內(nèi)介導(dǎo)病毒的脫衣殼和病毒基因組的釋放。近年研究發(fā)現(xiàn)，將豬源CD163分子轉(zhuǎn)染至PRRSV非允許細(xì)胞，使得細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)CD163蛋白后就成為PRRSV允許細(xì)胞，能夠成功感染增殖PRRSV，而其

3、他兩種受體則不能，說(shuō)明CD163在病毒感染細(xì)胞過(guò)程中至關(guān)重要。
　　作為清道夫受體超家族的成員，CD163參與機(jī)體對(duì)異物的免疫應(yīng)答并參與炎癥反應(yīng)，其在細(xì)胞表面的表達(dá)受多種因素的影響，其中去整合素金屬蛋白酶ADAM17已被證實(shí)能夠介導(dǎo)人源CD163的剪切調(diào)控，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。但是ADAM17能否介導(dǎo)豬源CD163的剪切調(diào)控從而影響病毒的入侵還不得而知，因此本研究闡釋了ADAM17介導(dǎo)CD163的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其對(duì)PRRSV感染的影

4、響。
　　首先，從PAM細(xì)胞中擴(kuò)增了豬源CD163基因，克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-CD163，在測(cè)序正確后將其轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和G418加壓篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)CD163的HEK293/CD163細(xì)胞系;病毒感染實(shí)驗(yàn)表明PRRSV能夠感染HEK293/CD163細(xì)胞系，為研究病毒的體外感染奠定了基礎(chǔ)。
　　其次，通過(guò)抑制劑、激活劑、siRNA基因干擾和基因過(guò)表達(dá)等方法來(lái)抑制或者增強(qiáng)PAM和HEK2

5、93/CD163細(xì)胞的ADAM17表達(dá)水平或活性，檢測(cè)ADAM17對(duì)豬源CD163的剪切能力。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ADAM17表達(dá)下調(diào)或者活性受到抑制時(shí)，細(xì)胞表面CD163的表達(dá)水平升高;當(dāng)ADAM17表達(dá)上調(diào)或者被激活時(shí)，細(xì)胞表面CD163的表達(dá)水平降低，說(shuō)明ADAM17介導(dǎo)豬源CD163的剪切調(diào)控。
　　最后，在HEK293/CD163細(xì)胞系和PAM進(jìn)行接毒實(shí)驗(yàn)，測(cè)定ADAM17介導(dǎo)的CD163表達(dá)對(duì)PRRSV感染的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果

6、發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用ADAM17抑制劑抑制ADAM17活性或者通過(guò)siRNA基因干擾下調(diào)ADAM17表達(dá)時(shí)，病毒感染量增多;當(dāng)用LPS激活A(yù)DAM17活性或通過(guò)基因過(guò)表達(dá)提高ADAM17表達(dá)時(shí)，病毒感染量減少。上述研究發(fā)現(xiàn)表明ADAM17通過(guò)調(diào)控細(xì)胞表面豬源CD163表達(dá)水平從而影響PRRSV入侵細(xì)胞的能力。
　　總之，本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和G418加壓篩選方法獲得了穩(wěn)定表達(dá)CD163的HEK293/CD163細(xì)胞系，并通過(guò)間接免疫熒光發(fā)鑒