AAV8介導(dǎo)的HBV感染大鼠模型建立研究.pdf

1、背景及目的:乙型肝炎病毒(hepatitisB virus，HBV)感染是影響人類健康的重要問題，據(jù)WHO報道，全球約20億人曾感染HBV，其中2.4億人為慢性HBV感染者。我國作為乙肝的高流行區(qū)，2006年全國乙型肝炎流行病學(xué)調(diào)查顯示我國一般人群HBsAg攜帶率為7.18％，乙肝病毒攜帶者約有9000萬人。慢性HBV感染可伴有肝纖維化發(fā)生，進(jìn)而可發(fā)展為肝硬化、肝癌。目前尚沒有特異的藥物可以根治乙肝，動物模型對于了解HBV感染的病理生理

2、學(xué)、病毒復(fù)制的相關(guān)機(jī)制以及該過程中發(fā)生的肝細(xì)胞損傷、肝纖維化，藥物療效評價等有重要意義。肝纖維化的動物模型主要有化學(xué)法、膽總管結(jié)扎、免疫法、尾靜脈注射轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒等，但這些模型無法模擬HBV感染的自然史。HBV具有嚴(yán)格的宿主特異性，故目前尚缺乏合適的HBV動物模型。AAV8作為一種嗜肝性病毒，其本身不具有致病性，可作為病毒載體攜帶HBV進(jìn)入大鼠肝臟，本研究通過對大鼠注射rAAV8-1.3HBV，觀察HBV在大鼠體內(nèi)的復(fù)制以及引起的肝臟病變

3、，旨在探索建立一種新型HBV感染動物模型，為進(jìn)一步研究HBV復(fù)制、致病機(jī)制、肝纖維化進(jìn)展等提供可能。
　　方法:本研究分別對0日齡乳鼠于0、2、4周腹腔注射rAAV8-1.3HBV以及對6周齡成年大鼠尾靜脈注射rAAV8-1.3HBV建模。注射rAAV8-1.3HBV后于多個時間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行尾靜脈采血100～200ul，分離血清，檢測大鼠血清中HBsAg、HBeAg、ALT及HBVDNA。12周末處死大鼠，取肝臟。做病理切片，行HE染

4、色及Masson染色，免疫組化檢測HBsAg、HBcAg、TGF-β1、α-SMA表達(dá)情況，評估肝臟損傷及纖維化情況。
　　結(jié)果:乳鼠腹腔注射rAAV8-1.3HBV2周后血中HBsAg和HBeAg均為強(qiáng)陽性，感染率100％，除1只大鼠偏低外，HBsAg平均2686.31±804.39 IU/ml，HBeAg平均63.60±31.60 NCU/ml，4周時HBsAg和HBeAg較前呈下降趨勢，8周和12周時仍有部分大鼠HBsAg和

5、HBeAg保持陽性。對照組HBsAg、HBeAg12周內(nèi)均為陰性。4周時實(shí)驗(yàn)組血中HBVDNA為1.39×105～1.06×107 IU/ml，隨時間延長，至12周時血中仍可檢測到較高拷貝的HBVDNA,表現(xiàn)為4.79×102～3.31×105IU/ml。肝臟中HBVDNA高于血清中HBVDNA。成年大鼠尾靜脈注射rAAV8-1.3HBV后3天血中即可檢測出HBsAg陽性，1周時HBsAg較前明顯上升，2周后開始下降，至12周基本變?yōu)殛?/p>

6、性。HBeAg結(jié)果與HBsAg表現(xiàn)不同，在注射后3天，rAAV8-1.3HBV組大鼠血中均未檢測到HBeAg，第2周時，HBeAg均為陽性，并保持穩(wěn)定至12周。
　　對照組HBsAg、HBeAg12周內(nèi)均為陰性。注射rAAV8-1.3HBV8h后，血中可檢測到極高拷貝數(shù)的HBVDNA，數(shù)值在3.47×1010～4.5×1010 IU/ml之間，24h時血中HBVDNA仍維持在1010數(shù)量級，從3天開始血中HBVDNA較前下降，但此

7、時血中HBVDNA仍可保持很高的拷貝數(shù)，4周時血中HBVDNA為2.20×103～1.12×105 IU/ml，之后維持穩(wěn)定至12周時。病理可見肝臟充血，部分肝細(xì)胞水腫，體積變大，排列紊亂，肝竇受壓變窄，可見嗜酸性變及散在點(diǎn)狀壞死，匯管區(qū)略增厚，可見淋巴細(xì)胞浸潤。免疫組化可見HBsAg、HBcAg陽性肝細(xì)胞，α-SMA、TGF-β1明顯陽性，提示肝星狀細(xì)胞活化，纖維化發(fā)生。
　　結(jié)論:通過注射rAAV8-1.3HBV，HBV可在大