Calponin-1介導(dǎo)分娩發(fā)動(dòng)的分子機(jī)制研究.pdf_第1頁(yè)
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1、分娩是由多因素作用、多途徑調(diào)節(jié)、多分子參與、多階段變化的變互作用過(guò)程。子宮平滑肌的收縮是分娩發(fā)動(dòng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。若能探明分娩發(fā)動(dòng)機(jī)制對(duì)病理妊娠計(jì)劃分娩、減少早產(chǎn)及高危兒的出生,具有重要的臨床意義。在前期的研究中,我課題組已應(yīng)用基因芯片技術(shù)得到了人類自然臨產(chǎn)與未臨產(chǎn)子宮體部與子宮下段的差異基因表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)Calponin—1等在臨產(chǎn)后的子宮體部及下段均呈高表達(dá),可能與調(diào)控子宮平滑肌細(xì)胞功能密切相關(guān)。Calponin-1蛋白結(jié)構(gòu)已經(jīng)研究清楚,但

2、對(duì)它在平滑肌收縮功能的調(diào)節(jié)機(jī)制研究大多集中在血管平滑肌上,對(duì)其參與子宮平滑肌收縮的調(diào)節(jié)機(jī)制研究較少。本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討Calponin-1基因表達(dá)上調(diào)在分娩發(fā)動(dòng)中調(diào)控子宮平骨肌細(xì)胞的分子機(jī)制。
   目的:探討Calponin-1在臨產(chǎn)前后子宮平滑肌組織中的表達(dá)及意義。
   方法:選取14例初產(chǎn)婦的子宮體部和子宮下段平滑肌組織,分為未臨產(chǎn)組(NIL)和臨產(chǎn)組(IL),采用免疫組織化學(xué)(Immunohis

3、tochemistry)和免疫印跡(western-blot)方法檢測(cè)Calponin-1蛋白(calponin—1)和磷酸化Calponin-1蛋白(pCalponin—1)的表達(dá)。
   結(jié)果:
   1.免疫組織化學(xué)
   14例子宮平滑肌組織中均可見(jiàn)Calponin—1及pCalponin-1蛋白陽(yáng)性表達(dá),陽(yáng)性表達(dá)定位在平滑肌細(xì)胞胞漿,呈棕黃色。
   (1)在未臨產(chǎn)組(NIL)與臨產(chǎn)組(IL)子

4、宮體平滑肌組織中Calponin-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)的平均灰度值分別為:184.91±5.12和167.32±5.22,兩組比較差異具有顯著性(ρ〈0.05):在未臨產(chǎn)組(NIL)與臨產(chǎn)組(IL)子宮下段平滑肌組織中Calponin-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)的平均灰度值分別為:174.51±4.82和165.42±4.52,兩組比較差異具有顯著性(ρ<0.05)。
   (2)在未臨產(chǎn)組(NIL)與臨產(chǎn)組(IL)子宮體平滑肌組織中pCalpo

5、nin-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)的平均灰度值分為:148.22±11.95和90.42±12.22,兩組比較差異具有顯著性(ρ<0.05);在未臨產(chǎn)組(NIL)與臨產(chǎn)組(IL)子宮下段平滑肌組織中pCalponin-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)的平均灰度值分別為:151.34±10.36和113.42±10.22,兩組比較差異具有顯著性(ρ<0.05)。
   2.免疫印跡
   (1)在未臨產(chǎn)組(NIL)與臨產(chǎn)組(IL)子宮體平滑肌組織中Ca

6、lponin-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為:0.373±0.092和0.865±0.090,兩組比較差異具有顯著性(ρ<0.05);在未臨產(chǎn)組(NIL)與臨產(chǎn)組(IL)子宮下段平滑肌組織中Calponin—1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為:0.522±0.102和0.957±0.081,兩組比較差異具有顯著性(ρ<0.05)。
   (2)pCalponin-1蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果顯示:未臨產(chǎn)組(NIL)和臨產(chǎn)(IL)組子宮體平滑肌組織中p

7、Calponin—1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為:0.303±0.071和0.532±0.063,兩組比較差異具有顯著性(ρ<0.05),未臨產(chǎn)組(NIL)和臨產(chǎn)(IL)組子宮下段平滑肌組織中pCalponin-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為:0.274±0.091和0.567±0.085,兩組比較差異具有顯著性(ρ<0.05)。
   結(jié)論:
   臨產(chǎn)后子宮平滑肌組織中Calponin-1及pCalponin-1蛋白的表達(dá)上調(diào)與

8、臨產(chǎn)后子宮平滑肌的收縮狀態(tài)有關(guān),提示臨產(chǎn)后子宮平滑肌的收縮可能部分依賴于Calponin—1及pCalponin—1的表達(dá)。
   目的:探討Calponin-1蛋白表達(dá)抑制對(duì)妊娠子宮平滑肌細(xì)胞功能的影響,研究其在分娩發(fā)動(dòng)中的分子作用機(jī)制。
   方法:采用消化酶法對(duì)人子宮平滑肌組織進(jìn)行子宮平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng),并用免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行鑒定。構(gòu)建腺病毒siRNA—Calponin-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染子宮平滑肌細(xì)胞沉默Calponi

9、n—1表達(dá),采用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell小室的變化、免疫熒光標(biāo)記和熒光顯微鏡觀察平滑肌細(xì)胞骨架蛋白F-actin表達(dá)的變化等方法研究Calponin-1調(diào)控子宮平滑肌細(xì)胞的作用,實(shí)驗(yàn)分三組:實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組、空載體組。
   結(jié)果:
   1.原代子宮平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
   培養(yǎng)的子宮平滑肌細(xì)胞呈典型的梭狀肌細(xì)胞樣生長(zhǎng),用平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體,經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示原代培養(yǎng)的子宮平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)

10、呈棕色,證明獲得的原代子宮平滑肌細(xì)胞符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。
   2.siRNA-Calponin-1腺病毒有效抑制Calponin—1 mRNA和蛋白的表達(dá)
   采用RT—PCR和Western-blot方法檢測(cè)pAd-mU6pro-Calponin-1-siRNA轉(zhuǎn)染后子宮平滑肌細(xì)胞中Calponin—1mRNA和蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組Calponin—lmRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.0

11、463±0.00045、0.2513±0.0552、0.3124±0.0037;實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組Calponin—1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.1098±0.0127、0.2758±0.0384、0.3187±0.0425。實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ρ<0.05),陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ρ>0.05)。
   3.體外實(shí)驗(yàn)中抑制Calponin-1的表達(dá)可以抑制子宮

12、平滑肌細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)而不影響其增殖和凋亡
   Transwell侵襲小室測(cè)定法結(jié)果顯示24小時(shí)培養(yǎng)后實(shí)驗(yàn)組、空載體組、空白對(duì)照組穿過(guò)Transwell的每低倍視野細(xì)胞數(shù)分別為64±12、122±14、125±10,實(shí)驗(yàn)組與空載體組、空白對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ρ<0.05);空載體組與空白對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后細(xì)胞的存活率,結(jié)果顯示三組細(xì)胞存活率兩兩比較差異

13、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,三組細(xì)胞凋亡率分別為4.22%、3.02%、4.64%,兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
   4.體外實(shí)驗(yàn)中抑制Calponin-1的表達(dá)可以引起子宮平滑肌細(xì)胞骨架蛋白F—actin的改變
   實(shí)驗(yàn)組子宮平滑肌細(xì)胞中F—actin排列紊亂、稀疏。空載體組與空白對(duì)照組子宮平滑肌細(xì)胞中F—actin微絲明顯粗長(zhǎng),大多沿細(xì)胞縱軸呈平行排列。實(shí)驗(yàn)組、空載體組、空

14、白對(duì)照組子宮平滑肌細(xì)胞中的F—actin熒光強(qiáng)度分別為832.22±99.02、1123.32±102.35、1089.19±110.53,實(shí)驗(yàn)組與空載體組、空白對(duì)照組比較差異具有顯著性(p<0.01);而空載體組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
   結(jié)論:
   1.構(gòu)建的Calponin-lsiRNA干擾質(zhì)粒能有效沉默Calponin—1基因表達(dá)。
   2.體外實(shí)驗(yàn)中抑制Calponin

15、—1的表達(dá)可以抑制子宮平滑肌細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)而不影響其增殖和凋亡。
   3.Calponin-1通過(guò)影響子宮平滑肌細(xì)胞中骨架蛋白F—actin的改變調(diào)節(jié)子宮平滑肌的收縮。
   目的:探討硫酸鎂及縮宮素調(diào)節(jié)子宮平滑肌細(xì)胞收縮與Calponin-1表達(dá)水平的相關(guān)性。
   方法:用硫酸鎂及縮宮素作用于體外培養(yǎng)的子宮平滑肌細(xì)胞,然后采用Western-blot及RT—PCR的方法對(duì)子宮平滑肌組織中Calponin-1

16、的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
   結(jié)果:
   1.體外硫酸鎂對(duì)子宮平滑肌細(xì)胞Calponin-1表達(dá)的影響
   2.體外縮宮素對(duì)子宮平滑肌細(xì)胞Calponin—1表達(dá)的影響
   結(jié)論:
   1.體外縮宮素可以上調(diào)子宮平滑肌細(xì)胞Calponin—1的表達(dá),且與其濃度及作用時(shí)間具有相關(guān)性,但與縮宮素作用濃度及作用時(shí)間并無(wú)明顯正/或負(fù)相關(guān)。
   2.縮宮素通過(guò)上調(diào)子宮平滑肌細(xì)胞Calponin-

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