FMDV3C蛋白酶抑制G3BP1介導(dǎo)的應(yīng)激顆粒形成的分子機(jī)制.pdf

1、口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是一種由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdisease virus，F(xiàn)MDV)引起的，具有高度傳染性的，能在牛、豬、羊等偶蹄類動物中廣泛傳播的疾病。其臨床癥狀表現(xiàn)為體質(zhì)虛弱，以及蹄、下肢和口部水皰的形成，具有高發(fā)病率和低死亡率的特點(diǎn)，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。FMDV感染宿主后能夠逃避宿主免疫，其3C蛋白酶(3C proteinase，3Cpro)在其中發(fā)揮了重要作

2、用，但具體機(jī)制還不是十分清楚。
　　應(yīng)激顆粒(stress granules，SGs)是真核細(xì)胞受環(huán)境刺激（包括病毒感染）時(shí)，蛋白翻譯起始暫停，翻譯起始復(fù)合物與核糖體40S亞基以及許多RNA結(jié)合蛋白在胞質(zhì)中聚集形成的致密顆粒，是細(xì)胞應(yīng)對環(huán)境刺激的一種保護(hù)性機(jī)制。許多研究表明，包括小RNA病毒在內(nèi)的許多病毒在感染細(xì)胞后能以各種方式影響SGs的形成，同時(shí)細(xì)胞產(chǎn)生的SGs也能從不同層面影響病毒增殖。鑒于此，本課題以FMDV為對象，研究F

3、MDV感染對SGs形成的影響及其分子機(jī)制。具體內(nèi)容如下:
　　1.FMDV不誘導(dǎo)SGs形成及3Cpro切割G3BP1以G3BP1作為SGs的生物標(biāo)記，通過間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)分別檢測FMDV感染和亞硝酸鹽（Arsenite，ARS）處理的IBRS-2細(xì)胞中SGs的形成情況。結(jié)果顯示，相比未處理組，ARS處理的IBRS-2細(xì)胞可以正常產(chǎn)生SGs，而FMDV感染不誘導(dǎo)SGs形成，且G3BP1含量顯著下降，推測病毒蛋白酶有可能參與

4、下調(diào)G3BP1的表達(dá)。將FMDV蛋白酶Lpro、3Cpro及其前體蛋白分別與G3BP1共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞中，Western Blot檢測G3BP1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示3Cpro及其前體蛋白可以切割G3 BP1，且切割效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴性。
　　2.FMDV3Cpro的蛋白酶活性參與切割G3BP1及抑制SGs的形成將3Cpro三個(gè)關(guān)鍵的蛋白酶活性位點(diǎn)分別進(jìn)行突變，然后與G3BP1共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，Western Blot檢測

5、發(fā)現(xiàn)，蛋白酶活性突變的3Cpro不能切割G3BP1，說明3Cpro的蛋白酶活性參與切割G3BP1。進(jìn)一步將3Cpro及蛋白酶活性突變體3CC163G分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，ARS刺激后觀察SGs的產(chǎn)生。通過IFA發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)3Cpro的293T細(xì)胞沒有SGs產(chǎn)生，而轉(zhuǎn)染了3CC163G的細(xì)胞則能形成正常的SGs，表明3Cpr能夠抑制SGs生成，且與其蛋白酶活性有關(guān)。此外，在添加蛋白酶體途徑抑制劑MG-132或細(xì)胞凋亡抑制劑Z-VAD后，W

6、estern Blot仍然能夠檢測到3Cpro切割G3BP1，說明這種切割效應(yīng)是特異性的，不依賴蛋白酶體及細(xì)胞凋亡途徑。
　　3.FMDV3Cpro切割G3BP1的位點(diǎn)鑒定根據(jù)G3BP1切割條帶大小及3Cpro的切割底物的特點(diǎn)，構(gòu)建了一系列G3BP1的位點(diǎn)突變體。通過Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，將G3BP1第284位谷氨酸(Glutamic acid，Glu)突變后，3Cpro不再切割G3BP1，說明切割位點(diǎn)在284位Glu