泛素連接酶APC-C-Cdc20介導Zwint-1蛋白的降解.pdf

1、目的：
　　作為著絲粒重要組件，Zwint-1參與招募動力蛋白激酶和動力蛋白，促進染色體運動或調控紡錘體檢查點，在著絲粒組裝和有絲分裂中期適當沉默 SAC起到關鍵作用，以此確保染色體正確分離。通過進一步實驗，來考察Cdc20與 Zwint-1之間的關系，以及 D-box序列在這其中發(fā)揮的作用，為進一步理解控制染色體分離的分子機制打下基礎。
　　方法：
　　經(jīng)PCR、雙酶切鑒定等一系列實驗技術來構建重組質粒pCMV-my

2、c-Cdc20、pcDNA3-flag-Zwint-1、pcDNA3-flag-Zwint-1ΔD-box、pEGFP-Zwint-1和 pEGFP-Zwint-1ΔD-box；采用胸腺嘧啶雙阻斷法將HEK293T細胞同步化在 G1/S期，用流式細胞術通過碘化丙啶染色來確定細胞時相，用Western blot檢測Zwint-1蛋白在細胞周期的表達水平；使用放線菌酮和MG132處理細胞，經(jīng)Western blot檢測來觀察Zwint-1蛋

3、白在體內的降解情況；對HEK293T細胞轉染了質粒 pCMV-myc-Cdc20，即過表達 hCdc20，做了Cdc20與 Zwint-1之間的免疫沉淀實驗；過表達 hCdc20和 RNA干擾 Cdc20，用Western blot來檢測內源性Zwint-1蛋白質水平；將分別編碼Zwint-1-flag、 Cdc20-myc和 Ub-HA的質粒共轉染 HEK293T細胞，做了體內泛素化分析；刪除了 Zwint-1的兩個D-box基序(1

4、28 RTQL131和203 RDKL206)，將突變序列亞克隆進pcDNA3-flag，與質粒pCMV-myc-Cdc20共轉染，用Western blot來檢測D-box缺失的Zwint-1蛋白質水平。
　　結果：
　　Zwint-1蛋白水平隨細胞周期時相變化而變化；Zwint-1蛋白水平在用放線菌酮孵育8 h和16 h后顯著降低，在用MG132孵育6 h和12 h后蛋白水平迅速增加；免疫沉淀結果為陰性；過表達 hCdc

5、20使 Zwint-1蛋白質含量顯著減少；RNA干擾抑制Cdc20活性時Zwint-1蛋白和cyclin B顯著積累；當過表達Cdc20-myc時，Zwint-1蛋白多泛素化水平顯著上升；缺乏D-box基序的Zwint-1不能被Cdc20識別降解。
　　結論：
　　Zwint-1的蛋白水平隨細胞周期出現(xiàn)周期性變化；Zwint-1通過 APC/C-Cdc20途徑泛素化降解；其機制是Cdc20識別Zwint-1的D-box基序。