FBXO31介導Snail1泛素化降解抑制胃癌上皮-間質轉化的研究.pdf

1、研究背景:
　　胃癌(GC)是世界常見的惡性腫瘤之一，在癌癥相關死亡中位居第三位，我國是胃癌高發(fā)區(qū)。胃癌患者生存期短、易復發(fā)，腫瘤的侵襲轉移是造成胃癌預后差的重要原因。目前認為上皮-間質細胞轉化(EMT)在腫瘤的侵襲轉移過程中發(fā)揮重要作用，過程中有多種轉錄因子(EMT-TFs)的參與，這些EMT-TFs是高度不穩(wěn)定的蛋白，易被蛋白酶體途徑泛素化降解。
　　FBXO31是F-box蛋白家族成員，參與Skp1-Cullin-F-

2、box(SCF)泛素E3連接酶復合物的形成，能夠介導泛素依賴性蛋白酶體降解途徑和調節(jié)信號轉導。我們前期研究發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中FBXO31的mRNA和蛋白水平明顯降低，且低表達與胃癌患者預后差、存活期限短等密切相關。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXO31高表達能夠顯著抑制人胃癌細胞的轉移侵襲能力，但具體的機制有待進一步研究。
　　研究目的:
　　1.探究FBXO31對胃癌細胞侵襲轉移能力的調控機制;
　　2.探討FBXO31能否通

3、過泛素化依賴性途徑降解EMT-TFs，并確定FBXO31與EMT-TFs間相互作用的關鍵結構域及分子機制。
　　實驗方法:
　　1.分子及細胞水平的研究
　　1.1.人胃癌細胞轉染FBXO31 siRNA，觀察細胞表型變化。然后，將FBXO31 siRNA及高表達質粒分別轉染胃癌細胞，細胞劃痕和Transwell實驗檢測FBXO31干擾和高表達對胃癌細胞侵襲轉移能力的影響。
　　1.2.FBXO31 siRNA和

4、高表達質粒分別轉染人胃癌細胞，qRT-PCR和Western blot檢測細胞中不同EMT-TFs在mRNA和蛋白水平的變化。
　　1.3.將FBXO31表達載體Myc-FBXO31及F-box結構域缺失的載體Myc-△FBXO31分別與EMT-TF Snail1的表達載體Flag-Snail1共轉染胃癌細胞，Western blot和Co-IP檢測FBXO31與Snail1的相互作用，并通過泛素化實驗檢測FBXO31能否引起Sn

5、ail1的泛素化降解。
　　1.4.Myc-FBXO31高表達載體分別與Flag-Snail1的野生型和磷酸化位點突變的載體共轉染胃癌細胞，Co-IP檢測Snail1的降解是否需要發(fā)生磷酸化。
　　2.動物水平的研究
　　構建篩選FBXO31高表達的穩(wěn)轉細胞系(BGC-FBXO31)，對裸鼠尾靜脈注射，6周后觀察并分析裸鼠體內肺轉移的情況。
　　3.臨床標本的研究
　　收集77例人胃癌及對應癌旁組織，Wes

6、tern blot檢測組織中FBXO31與Snail1的表達并分析二者的相關性。
　　實驗結果:
　　1.分子及細胞水平
　　1.1.胃癌細胞FBXO31干擾后細胞呈現(xiàn)長梭形，細胞間粘著性降低。細胞劃痕和Transwell實驗結果表明，F(xiàn)BXO31沉默能促進胃癌細胞侵襲轉移，F(xiàn)BXO31高表達能抑制胃癌細胞侵襲轉移。
　　1.2.FBXO31 siRNA和高表達質粒轉染胃癌細胞，EMT-TF Snail1在mRN

7、A水平沒有變化，在蛋白水平可被FBXO31下調。
　　1.3.Co-IP結果顯示FBXO31能與Snail1相互結合，且F-box結構域對于二者的相互作用是必需的，體內泛素化實驗結果表明FBXO31能引起Snail1的泛素化，進一步研究發(fā)現(xiàn)FBXO31與Snail1的相互作用依賴于Snail1的磷酸化。
　　2.動物水平的研究
　　動物實驗表明高表達的FBXO31能顯著抑制裸鼠體內胃癌細胞的侵襲轉移。
　　3.臨

8、床標本的研究
　　Western blot結果顯示:與癌旁組織相比，胃癌組織中FBXO31顯著低表達，而Snail1顯著高表達，二者在胃癌組織中的表達呈顯著負相關。
　　實驗結論:
　　研究結果表明，F(xiàn)BXO31能夠泛素化降解EMT相關轉錄因子Snail1，進而抑制胃癌細胞的侵襲轉移能力。在二者的相互作用中，F(xiàn)BXO31的F-box結構域和Snail1的GSK-3β磷酸化基序是不可或缺的。該研究闡明了FBXO31抑制胃