增齡對小鼠肺纖維化模型上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及Snail影響的研究.pdf

1、目的：
　　研究不同年齡段（青年、老年）小鼠實驗性肺纖維化中上皮細胞-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關指標：上皮細胞標志物E-鈣粘蛋白(E-Cadherin, E-Cad)，間質(zhì)細胞標志物α平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle Actin，α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)及轉(zhuǎn)錄因子Snail隨病程進展的表達變化，初步探討增齡對小鼠肺纖維化病

2、變程度及EMT的影響，為進一步探索增齡促進肺纖維化進展的可能機制提供依據(jù)。
　　方法：
　　20周齡雄性C57/BL6小鼠60只，隨機分為兩組：青年組（20周齡）、老年組（飼養(yǎng)至26周齡）。上述兩組每組再隨機分為5組，其中1組作為生理鹽水對照組(NS)，給予氣管內(nèi)注入0.9％氯化鈉注射液，于第28d處死；其余4組為肺纖維化模型組，按5mg/kg劑量，予氣管內(nèi)注入博來霉素(bleomycin,BLM)，分別于造模后第7d、14

3、d、21d及28d處死，取左肺制備石蠟切片，右肺液氮凍存后行相關蛋白RT-PCR檢測。石蠟切片行HE染色及Masson染色，通過肺組織形態(tài)改變從而判斷肺纖維化病變進展程度；免疫組織化學染色檢測EMT相關指標 E-Cadherin、Vimentin、α-SMA蛋白的表達水平，平均光灰度值使用美國Universal Imaging Porporation圖像分析系統(tǒng)測量，反映病程中EMT的動態(tài)變化；RT-PCR法檢測液氮凍存肺組織轉(zhuǎn)錄因子S

4、nail1、Snail2及其調(diào)控蛋白E-cad的mRNA的表達水平。使用SPSS19.0對上述數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均采取“均數(shù)標準差”表示，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　HE染色及Masson染色結(jié)果示BLM誘導的小鼠肺纖維化模型組，隨病程進展，肺實質(zhì)破壞、膠原生成量較對照組增加明顯，表明造模成功。將老年與青年小鼠同時間點的纖維化病變程度進行對比，前者更嚴重。免疫組化法結(jié)果顯示，E-Cadherin

5、主要表達于肺泡上皮細胞、支氣管黏膜上皮細胞。青年、老年兩組小鼠對照組表達較多，各時間點模型組的表達較對照組減少，且隨病程進展，減少更為明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；進一步將兩組模型小鼠的各個對應時間點表達量進行比較，老年較青年組表達較少（P<0.05），而兩組對照組無明顯差異。Vimentin主要表達于支氣管黏膜上皮及肺間質(zhì)細胞，α-SMA在對照組只表達于支氣管及血管平滑肌細胞，而在模型組肺間質(zhì)肌成纖維細胞中還可觀測到其表達。

6、上述兩個指標在各時間點模型組表達較對照組增加，隨病程進展，增多更顯著（P<0.05）；同時間點老年模型組較青年模型組表達較多（P<0.05），兩組對照組無明顯差異。
　　RT-PCR法結(jié)果示在青年、老年兩組小鼠中，隨時間推移，Snail1及Snail2的表達均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢（相較對照組，模型組14d表達量明顯增加，28d較14d表達明顯減少，P<0.05）。對比兩組小鼠同時間點的表達情況，老年模型組較青年模型組于14d增加

7、更為明顯，28d減少更為緩慢（P<0.05），兩組對照組無明顯差異。E-Cadherin模型組14d、28d的表達較對照組減少，且隨病程進展，減少更為明顯（P<0.05）。相較青年模型組，同時間點老年模型組表達較少（P<0.05），兩組對照組無明顯差異，與免疫組化結(jié)果基本一致。
　　結(jié)論：
　　BLM氣管內(nèi)注入誘導小鼠肺纖維化模型成功，同時期老年模型組相較青年模型組肺纖維化及EMT程度更嚴重，而對照組無明顯差異。老年模型組S