FOXQ1介導(dǎo)TGF-β1-Smad信號(hào)通路調(diào)控膀胱癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分人膀胱移行細(xì)胞癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與核轉(zhuǎn)錄因子FOXQ1的關(guān)系
　　目的：探討膀胱移行細(xì)胞癌(BTCC)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與核轉(zhuǎn)錄因子FOXQ1的相關(guān)性,以及FOXQ1與膀胱癌臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　方法：選用膀胱移行細(xì)胞癌手術(shù)切除標(biāo)本65例,每例標(biāo)本均選用癌組織中心、癌旁組織及其遠(yuǎn)端正常粘膜組織對(duì)照。采用免疫組織化學(xué)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Westernblot技術(shù)檢測(cè)各例標(biāo)本中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1、

2、核轉(zhuǎn)錄因子FOXQ1及上皮間質(zhì)標(biāo)記物E-cadherin和Vimentin的表達(dá),并分析與臨床病理因素之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：(1)FOXQ1在BTCC組織中的表達(dá)高于正常粘膜組織(89.2％比13.8%,P<0.05),其在肌層浸潤(rùn)性癌中的表達(dá)高于淺表性癌(97.3%比78.6%),在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌(100%比86.8%);TGF-β1在BTCC組織中的表達(dá)高于正常黏膜(76.9%比26.2%,P<

3、0.05);E-cadherin在BTCC組織中的表達(dá)低于正常黏膜(27.7%比89.2%,P<0.05);Vimentin在BTCC組織中的表達(dá)高于正常黏膜(83.1%比20.0%,P<0.05)。(2)FOXQ1與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān),與TGF-β1、Vimentin表達(dá)呈正相關(guān),是EMT的正向調(diào)控因子。
　　結(jié)論：核轉(zhuǎn)錄因子FOXQ1與膀胱移行細(xì)胞癌分化和轉(zhuǎn)移有關(guān),可能通過(guò)調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而促進(jìn)膀胱移行細(xì)胞癌的

4、侵襲轉(zhuǎn)移。
　　第二部分短發(fā)夾RNA靶向沉默F(xiàn)OXQ1基因?qū)Π螂装┥掀らg質(zhì)轉(zhuǎn)化的逆轉(zhuǎn)作用
　　目的：觀察轉(zhuǎn)錄因子FOXQ1基因沉默對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的逆轉(zhuǎn),探討其在促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。
　　方法：構(gòu)建針對(duì)FOXQ1基因的shRNA真核表達(dá)載體,脂質(zhì)體Lipofactamine2000介導(dǎo)FOXQ1干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人膀胱癌細(xì)胞株T24細(xì)胞;轉(zhuǎn)染48h后采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、Wester

5、nblot法檢測(cè)FOXQ1、上皮間質(zhì)標(biāo)記物E-cadherin、N-cadherin和vimentin的表達(dá)改變;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)體外細(xì)胞遷移和侵襲能力;噻唑藍(lán)(MTT)比色法和AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)shRNA對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的作用。
　　結(jié)果：與轉(zhuǎn)染NC-shRNA陰性對(duì)照組比較,轉(zhuǎn)染FOXQ1-shRNA48h后的T24細(xì)胞,FOXQ1和間質(zhì)標(biāo)記基因N-cadherin、vi

6、mentin的mRNA或蛋白表達(dá)下降,而上皮標(biāo)記基因E-cadherin的mRNA或蛋白表達(dá)顯著增加;轉(zhuǎn)染后的T24細(xì)胞形態(tài)向正常上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化,體外遷移能力與侵襲力下降[(15.4±1.4)%比(76.5±1.1)%,P<0.05];細(xì)胞增殖明顯抑制(57.8%比82.7%,P<0.05),同時(shí)細(xì)胞凋亡率增加(37.6%比14.2%,P<0.05)。
　　結(jié)論：靶向沉默F(xiàn)OXQ1基因可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的間質(zhì)表型,向正常上皮表型轉(zhuǎn)化,

7、遏制癌細(xì)胞遷移和侵襲,降低腫瘤轉(zhuǎn)移潛能。
　　第三部分FOXQ1介導(dǎo)TGF-β1/Smad信號(hào)通路的作用研究
　　目的：觀察FOXQ1基因沉默對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響,分析TGF-β1和FOXQ1在膀胱癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,進(jìn)一步明確腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。
　　方法：采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的shRNA干擾技術(shù)將將真核質(zhì)粒載體FOXQ1-shRNA和nc-shRNA轉(zhuǎn)染BIU-87細(xì)胞,8小時(shí)后給

8、予或不給5ng/mlTGF-β1,建立四組工作細(xì)胞系:(nc-shRNA);(nc-shRNA+5ng/mlTGF-β1);(FOXQ1-shRNA);(FOXQ1-shRNA+5ng/mlTGF-β1)。40h后倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化,檢測(cè)每組細(xì)胞FOXQ1的mRNA和蛋白表達(dá)情況;實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Westernblot檢測(cè)上皮間質(zhì)標(biāo)記物E-cadherin,Vimentin。觀察TGF-β1對(duì)FOXQ1表達(dá)水平和BIU-

9、87細(xì)胞形態(tài)表型的調(diào)控,及敲低FOXQ1基因后對(duì)TGF-β1調(diào)控上皮間質(zhì)標(biāo)記物表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：(nc-shRNA+5ng/mlTGF-β1)組與(nc-shRNA)組相比,在外源性TGF-β1作用下,膀胱癌BIU-87細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,具有間質(zhì)表型特征,FOXQ1的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào);(FOXQ1-shRNA+5ng/mlTGF-β1)與(nc-shRNA+5ng/mlTGF-β1)組相比FOXQ1的mRNA和蛋白表達(dá)