MTDH通過Wnt信號通路介導上皮間質轉化對膀胱癌細胞功能學影響的機制研究.pdf

1、膀胱癌是泌尿系最常見的惡性腫瘤，臨床上，膀胱癌多采用腫瘤切除，術后輔助化療。然而，由于膀胱癌的高轉移性，膀胱癌的復發(fā)率及死亡率仍然很高。故研究膀胱癌的轉移機制是很有必要的。MTDH是近年來發(fā)現(xiàn)的癌基因，已有報道其在惡性腫瘤中表達較高。上皮間質轉化(EMT)是上皮細胞獲得間質表型，易于侵襲轉移的特性，其經典上皮標志物為E-cadherin。有報道顯示，在惡性腫瘤中，MTDH可促進EMT發(fā)生，而EMT是膀胱癌發(fā)生侵襲、轉移的重要原因。目前，

2、在膀胱癌中尚無MTDH與EMT的相關研究。本研究擬通過分析在膀胱癌組織及細胞中MTDH與E-cadherin的表達關系，探討MTDH與EMT是否存在某種聯(lián)系，進而采用基因沉默及過表達技術，深入研究MTDH對EMT的影響，及MTDH促進膀胱癌細胞侵襲、轉移的機制。
　　第一部分 MTDH和E-cadherin在膀胱癌組織及細胞中的表達及臨床意義
　　目的：
　　檢測MTDH、E-cadherin在膀胱癌組織及細胞中的表達

3、，探討MTDH、E-cadherin與臨床病理特征的關系，以及MTDH與E-cadherin表達的相關性。
　　方法：
　　1.應用免疫組化（immunohistochemistry，IHC）SP法檢測膀胱癌組織中MTDH和EMT上皮標志物E-cadherin的表達水平。分析MTDH、E-cadherin蛋白表達與臨床病理特征之間的關系，Spearman’s法分析MTDH與E-cadherin表達可能存在的相關性。
　

4、　2. Real-time PCR方法檢測MTDH與E-cadherin在膀胱癌細胞株、尿路上皮細胞株中mRNA的表達水平。
　　3. Western blot方法檢測在膀胱癌細胞株、尿路上皮細胞株MTDH與E-cadherin蛋白的表達水平。
　　結果：
　　1.與癌旁組織比較，癌組織MTDH的蛋白表達水平明顯增高, E-cadherin的表達水平明顯降低。MTDH、E-cadherin表達與患者年齡、性別、腫瘤大小

5、、數(shù)量無關，與腫瘤遠處轉移、臨床分期、病理分級有關。MTDH與E-cadherin的蛋白表達之間呈負相關（r=-0.722, P<0.05）。
　　2.膀胱癌細胞株5637、T24中MTDH mRNA表達水平相對于人尿路上皮細胞株SV-HUC-1中顯著升高；E-cadherin mRNA表達水平在膀胱癌細胞株5637、T24中相對于人尿路上皮細胞株SV-HUC-1中顯著降低。
　　3.膀胱癌細胞株5637、T24中MTDH蛋

6、白表達水平相對于人尿路上皮細胞株SV-HUC-1中顯著升高；E-cadherin的蛋白表達水平在膀胱癌細胞株5637、T24中相對于其在人尿路上皮細胞株SV-HUC-1中顯著降低。
　　結論：
　　MTDH在膀胱癌組織及細胞中高表達，E-cadherin在癌旁組織及正常細胞中高表達。MTDH與腫瘤臨床病理學特征密切相關，可作為判斷腫瘤臨床病理的分子指標。MTDH與E-cadherin呈負相關，相互之間存在負向調控。
　

7、　第二部分 MTDH基因沉默對膀胱癌細胞功能學影響及其機制研究
　　目的：
　　探討抑制MTDH表達對膀胱癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響及MTDH沉默對上皮間質轉化相關標志物的影響
　　方法：
　　1. Real-time PCR檢測siRNA-MTDH轉染5637和T24細胞后MTDH mRNA變化情況，Western blot方法檢測siRNA-MTDH轉染5637和T24細胞后，MTDH蛋白表達情況，分

8、析siRNA的抑制效率，最終篩選出沉默效率最高的siRNA。
　　2.通過CCK8法檢測MTDH基因沉默后5637和 T24的增殖能力的變化，流式細胞術檢測MTDH基因沉默對5637和T24細胞凋亡的影響，細胞劃痕實驗檢測MTDH基因沉默對5637、T24細胞遷移能力的影響， Transwell實驗檢測MTDH基因沉默對5637、T24細胞的侵襲能力的影響。
　　3. Real-time PCR方法檢測siRNA2-MTDH

9、轉染5637、T24細胞后上皮間質轉化相關標志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin mRNA的表達變化。Western blot檢測siRNA2-MTDH轉染5637、T24細胞后上皮間質轉化相關標志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白的表達變化。細胞免疫熒光技術檢測siRNA2-MTDH轉染5637、T24細胞后上皮間質轉化相關標志物E-cadherin、N-cadherin、V

10、imentin熒光表達變化。
　　結果：
　　1.從基因及蛋白水平驗證siRNA2-MTDH沉默效率大于70％，篩選確定siRNA2用于后續(xù)實驗。
　　2. CCK8法實驗結果顯示：與對照組相比，MTDH基因沉默后膀胱癌細胞5637、T24的增殖能力明顯降低，流式細胞儀檢測結果提示MTDH基因沉默后5637、T24凋亡率較對照組明顯增加，細胞劃痕實驗、Transwell實驗結果提示MTDH基因沉默后5637、T24細胞

11、遷移及侵襲能力顯著降低。
　　3. Real-time PCR、Western blot實驗提示siRNA2-MTDH轉染5637、T24細胞后上皮相關標志物E-cadherin mRNA及蛋白表達顯著增高，而間質標志物N-cadherin、Vimentin mRNA及蛋白表達顯著降低。細胞免疫熒光技術檢測提示siRNA2-MTDH轉染5637、T24細胞后相關標志物E-cadherin熒光表達增強，陽性細胞數(shù)增多；而N-cadh

12、erin、Vimentin熒光表達減弱，陽性細胞數(shù)減少。
　　結論：
　　MTDH基因沉默抑制膀胱癌細胞增殖，促進其凋亡，抑制膀胱癌細胞遷移及侵襲，促進上皮標志物表達，抑制間質標志物表達，抑制上皮間質轉化。
　　第三部分 MTDH過表達對膀胱癌細胞功能學影響及其機制研究
　　目的：
　　探討MTDH過表達對膀胱癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響及MTDH過表達對上皮間質轉化相關標志物的影響
　　方法：

13、
　　1.構建MTDH過表達慢病毒載體GV341-MTDH及GV341-NC，制備慢病毒濃縮液LV-MTDH，LV-NC，感染5637、T24細胞，建立過表達MTDH的LV-MTDH單克隆細胞株及陰性對照組LV-NC細胞株。Real-time PCR檢測5637和T24細胞過表達MTDH后MTDH mRNA變化情況，Western blot方法檢測5637和T24細胞過表達MTDH后，MTDH蛋白表達情況。
　　2.通過CC

14、K8法檢測5637和 T24細胞MTDH過表達后增殖能力的變化，流式細胞術檢測MTDH基因過表達對5637和 T24細胞凋亡的影響，細胞劃痕實驗檢測MTDH基因過表達對5637、T24細胞遷移能力的影響， Transwell實驗檢測MTDH基因過表達對5637、T24細胞的侵襲能力的影響。
　　3. Real-time PCR方法檢測5637、T24細胞MTDH過表達后上皮間質轉化相關標志物E-cadherin、N-cadheri

15、n、Vimentin mRNA的表達變化。Western blot檢測5637、T24細胞MTDH過表達后上皮間質轉化相關標志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達變化。細胞免疫熒光技術檢測5637、T24細胞MTDH過表達后E-cadherin、N-cadherin、Vimentin熒光表達變化。
　　結果：
　　1. MTDH過表達慢病毒載體構建成功，從基因及蛋白水平證實成功建立過表達MT

16、DH的LV-MTDH單克隆細胞株及陰性對照組LV-NC細胞株。
　　2. CCK8法實驗結果顯示：與對照組相比，MTDH過表達后膀胱癌細胞5637、T24的增殖能力明顯增強，流式細胞儀檢測結果提示MTDH過表達后5637、T24凋亡率較對照組明顯降低，細胞劃痕實驗、Transwell實驗結果提示MTDH基因過表達后5637、T24細胞遷移及侵襲能力顯著增強。
　　3. Real-time PCR、Western blot實驗

17、提示5637、T24細胞MTDH基因過表達后上皮間質轉化相關標志物E-cadherin mRNA及蛋白表達明顯減弱，而N-cadherin、Vimentin mRNA及蛋白表達顯著增強。細胞免疫熒光技術檢測提示5637、T24細胞MTDH基因過表達后E-cadherin熒光表達減弱，陽性細胞數(shù)減少；而N-cadherin、Vimentin熒光表達增強，陽性細胞數(shù)增多。
　　結論：
　　MTDH基因過表達促進膀胱癌細胞增殖，抑

18、制其凋亡，增強膀胱癌細胞遷移及侵襲能力，抑制上皮標志物表達，提高間質標志物表達，促進上皮間質轉化。
　　第四部分 MTDH過表達對T24、5637細胞Wnt/β-catenin信號通路及其下游靶基因的調控
　　目的：
　　探討MTDH過表達對T24、5637細胞Wnt/β-catenin信號通路及其下游靶基因的調控
　　方法：
　　1.Western blot檢測 MTDH過表達對5637、T24細胞 Wn

19、t/β-catenin信號通路、下游靶基因及基質金屬蛋白酶MMP9蛋白表達的影響
　　2.免疫熒光檢測MTDH過表達5637和T24細胞對β-catenin熒光表達的影響
　　結果：
　　1.Western blot實驗提示5637、T24細胞MTDH基因過表達后Wnt通路被激活，細胞內β-catenin總蛋白表達增多，胞核β-catenin蛋白表達顯著增多，而胞質β-catenin蛋白表達明顯減低，c-Myc及MMP