TGF-β1介導(dǎo)TGF-β1-Smad及ERK-MAPK通路協(xié)同促進(jìn)大鼠骨髓炎瘢痕形成的機(jī)制研究.pdf

1、第一章大鼠骨髓炎動(dòng)物模型建立和評(píng)估的研究
　　研究背景
　　骨髓炎是是致病微生物感染骨及周圍組織并引起骨破壞的急慢性炎性反應(yīng)過(guò)程，按照感染來(lái)源可以分類為血源性骨髓炎、創(chuàng)傷性骨髓炎和臨近組織感染性骨髓炎。創(chuàng)傷性骨髓炎是由外傷、手術(shù)等因素引起的骨感染，臨床上治療極為棘手，它的病理特點(diǎn)表現(xiàn)為病原菌持續(xù)存在、炎癥反復(fù)刺激、周圍組織瘢痕以及死骨形成，常常發(fā)展為慢性骨髓炎。由于其治療時(shí)間長(zhǎng)、治療效果差，病程遷延不愈，有些病人最終面臨截肢

2、的后果，給病人和社會(huì)帶來(lái)繁重的負(fù)擔(dān)。臨床上創(chuàng)傷性骨髓炎的病理生理過(guò)程復(fù)雜多變，因而建立一種穩(wěn)定的創(chuàng)傷性骨髓炎動(dòng)物模型，對(duì)理解骨髓炎的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程并指導(dǎo)臨床骨髓炎的預(yù)防及治療，有著重要的意義。
　　多種動(dòng)物可用于制作骨髓炎模型，大型動(dòng)物具有耐受性好等優(yōu)點(diǎn)，但是花費(fèi)高，小型動(dòng)物利于操作、花費(fèi)低，但是耐受性差。應(yīng)根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。骨髓炎動(dòng)物模型的制作方法也不盡相同，有局部細(xì)菌注射、局部硬化劑注射、異物植入等方法，目

3、前沒(méi)有統(tǒng)一的骨髓炎動(dòng)物模型制作標(biāo)準(zhǔn)。
　　研究目的
　　在文獻(xiàn)及前期研究基礎(chǔ)上，建立一種穩(wěn)定的、能夠模擬臨床中創(chuàng)傷性骨髓炎發(fā)生機(jī)制的骨髓炎動(dòng)物模型，并建立骨髓炎相關(guān)指標(biāo)評(píng)價(jià)體系，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　研究方法
　　30只wistar大鼠分為兩組，A組為空白對(duì)照組，B組為骨髓炎模型組。每組15只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分別于7，14，28天取材。根據(jù)取材時(shí)間A、B兩組各分為3個(gè)亞組。其中A組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物切開(kāi)皮膚肌肉顯露一側(cè)股骨后直

4、接縫合，B組為骨髓炎模型組，動(dòng)物模型制作具體操作如下:大鼠腹腔注射水合氯醛溶液腹腔麻醉生效后，下肢常規(guī)剃毛后固定四肢于木板，術(shù)區(qū)消毒、鋪洞巾，采用股骨外側(cè)入路，縱向切開(kāi)皮膚、肌肉，顯露一側(cè)股骨中段，利用咬骨鉗在股骨中段咬成小蝶形骨塊，造成股骨干骨折，自股骨大轉(zhuǎn)子順骨髓腔鉆入直徑為1.0cm的克氏針固定股骨，將50ul濃度為106CFU/ml的金黃色葡萄球菌懸液注射于骨折斷端，表面覆蓋明膠海綿減少細(xì)菌懸液溢出，將游離蝶形骨折塊回植，逐層縫

5、合切口。術(shù)后觀察兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物7，14，28天的切口愈合情況;于術(shù)后7，14，28天分別拍攝股骨X線，觀察骨折端軟組織腫脹程度、骨膜反應(yīng)及骨質(zhì)改變;術(shù)后7，14，28天分別留取肌肉組織及骨骼組織標(biāo)本，利用HE染色方法觀察肌肉組織及骨骼組織細(xì)微結(jié)構(gòu)的變化，利用細(xì)菌學(xué)方法培養(yǎng)骨骼組織觀察細(xì)菌感染情況，培養(yǎng)出金黃色葡萄球菌為模型制作成功標(biāo)準(zhǔn)。
　　研究結(jié)果
　　對(duì)照組術(shù)后手術(shù)部位愈合良好，未見(jiàn)切口感染表現(xiàn);骨髓炎組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后7天出

6、現(xiàn)手術(shù)部位腫脹，術(shù)后14天手術(shù)部位少量膿液溢出，術(shù)后28天手術(shù)部位大量膿液、死骨排出。對(duì)照組術(shù)后X線骨質(zhì)正常;骨髓炎組術(shù)后X線7天可見(jiàn)輕度骨膜反應(yīng)，術(shù)后14天可見(jiàn)骨膜反應(yīng)加重，部分骨痂形成，骨皮質(zhì)變薄，髓腔變寬，術(shù)后28天可見(jiàn)感染征象，骨質(zhì)破壞，呈蟲蝕樣改變，硬化骨形成，失去正常髓腔結(jié)構(gòu)。對(duì)照組軟組織HE染色未見(jiàn)感染及肉芽組織增生征象;骨髓炎組術(shù)后7天肌肉軟組織HE染色見(jiàn)骨骼肌細(xì)胞壞死，大量中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)，術(shù)后14天骨骼肌細(xì)胞

7、稀疏、大量毛細(xì)血管增生，組織內(nèi)成纖維細(xì)胞增生，術(shù)后28天組織內(nèi)旋渦狀肉芽組織增生，瘢痕形成表現(xiàn)。對(duì)照組術(shù)后骨質(zhì)HE染色呈正常形態(tài)，骨皮質(zhì)完整有序;骨髓炎組骨骼HE染色在術(shù)后7天可見(jiàn)骨皮質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，術(shù)后14天見(jiàn)骨皮質(zhì)內(nèi)骨質(zhì)吸收，髓腔擴(kuò)大，術(shù)后28天見(jiàn)炎細(xì)胞減少，骨質(zhì)稀疏，骨皮質(zhì)破壞較重。對(duì)照組骨骼組織細(xì)菌培養(yǎng)陰性，骨髓炎組術(shù)后7、14、28均培養(yǎng)出金黃色葡萄球菌。
　　研究結(jié)論
　　通過(guò)我們改良的方法，能模擬臨床創(chuàng)傷性骨髓

8、炎發(fā)生過(guò)程，制作出穩(wěn)定的骨髓炎動(dòng)物模型，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供保障。
　　第二章 TGF-β1/Smad及ERK/MAPK信號(hào)通路的表達(dá)變化與大鼠骨髓炎周圍軟組織瘢痕形成之間的關(guān)系
　　研究背景
　　骨髓炎具有遷延不愈的特點(diǎn)，慢性炎癥刺激可逐步影響到周圍軟組織，導(dǎo)致軟組織瘢痕形成。一方面，骨髓炎周圍軟組織瘢痕的形成不利于血液循環(huán)微環(huán)境的建立，影響抗菌藥物到達(dá)病灶發(fā)揮抗炎作用;另一方面，骨髓炎周圍軟組織瘢痕對(duì)肢體美觀及功能也有影

9、響。骨髓炎的治療宜采用抗生素藥物治療與手術(shù)清除壞死感染組織相結(jié)合的方法，無(wú)論是手術(shù)治療還是抗菌藥物治療，減輕局部瘢痕形成從而建立一個(gè)有血運(yùn)的微環(huán)境對(duì)骨髓炎的治療至關(guān)重要。TGF-β1是引起纖維化疾病的重要細(xì)胞因子之一，其介導(dǎo)的經(jīng)典的TGF-β1/Smad信號(hào)通路以及非經(jīng)典的ERK/MAPK信號(hào)通路在纖維化疾病形成中起重要作用，然而骨髓炎中瘢痕化機(jī)制是否與TGF-β1介導(dǎo)的TGF-β1/Smad及ERK/MAPK信號(hào)通路有關(guān)還未被闡明，研

10、究骨髓炎中瘢痕形成機(jī)制對(duì)臨床上骨髓炎的預(yù)防、治療有重要意義。
　　研究目的
　　1.研究骨髓炎動(dòng)物模型中軟組織瘢痕形成的時(shí)間。
　　2.研究TGF-β1介導(dǎo)的TGF-β1/Smad信號(hào)通路以及ERK/MAPK信號(hào)通路的表達(dá)變化，與骨髓炎周圍軟組織瘢痕形成之間的關(guān)系。
　　研究方法
　　30只wistar大鼠分為兩組，A組為空白對(duì)照組，B組為骨髓炎模型組。每組15只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分別于7，14，28天取材。根據(jù)取

11、材時(shí)問(wèn)A、B兩組各分為A1-3以及B1-3個(gè)亞組。根據(jù)第一章模型制作方法，利用金黃色葡萄球菌制作大鼠骨髓炎動(dòng)物模型。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)軟組織中TGF-β1表達(dá)變化，MASSON染色檢測(cè)膠原沉積程度，Western blot檢測(cè)TGF-β1/Smad信號(hào)通路、ERK/MAPK信號(hào)通路以及Ⅰ型膠原的表達(dá)變化。
　　研究結(jié)果
　　TGF-β1免疫組織化學(xué)染色顯示，對(duì)照組中在1周、2周、4周時(shí)TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)分?jǐn)?shù)分別為11.0

12、8％、13.86％、13.62％，骨髓炎組TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)分?jǐn)?shù)在1周、2周、4周時(shí)分別為19.07％、56.35％、83.12％，骨髓炎組與對(duì)照組相比，1周時(shí)TGF-β1表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，2周及4周時(shí)TGF-β1表達(dá)水平增高，有顯著性差異(P＜0.05); MASSON染色顯示，對(duì)照組中在1周、2周、4周時(shí)膠原容積分?jǐn)?shù)分別為0.19％、0.11％、0.85％，骨髓炎組膠原容積分?jǐn)?shù)在1周、2周、4周時(shí)分別為1.37％、

13、43.72％、83.59％，骨髓炎組與對(duì)照組相比，1周時(shí)膠原容積分?jǐn)?shù)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，2周及4周時(shí)膠原容積分?jǐn)?shù)有顯著性差異(P＜0.05);Western blot顯示，對(duì)照組中在1周、2周、4周時(shí)TGF-β1/GAPDH灰度值比值分別為35.80％、34.86％、33.94％，骨髓炎組中在1周、2周、4周時(shí)TGF-β1/GAPDH灰度值比值分別為34.47％、80.52％、225.95％。骨髓炎組與對(duì)照組相比，1周時(shí)TGF

14、-β1表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，2周及4周時(shí)TGF-β1表達(dá)水平增高，有顯著性差異(P＜0.05);對(duì)照組中在1周、2周、4周時(shí)pSmad2/Smad2/3灰度值比值分別為8.10％、8.61％、8.93％，骨髓炎組中在1周、2周、4周時(shí)pSmad2/Smad2/3灰度值比值分別為8.34％、17.61％、33.71％。骨髓炎組與對(duì)照組相比，1周時(shí)pSmad2表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，2周及4周時(shí)pSmad2表達(dá)水平增高

15、，有顯著性差異(P＜0.05);對(duì)照組中在1周、2周、4周時(shí)pSmad3/Smad2/3灰度值比值分別為7.45％、6.35％、7.69％，骨髓炎組中在1周、2周、4周時(shí)pSmad3/Smad2/3灰度值比值分別為7.39％、15.54％、51.95％。骨髓炎組與對(duì)照組相比，1周時(shí)pSmad3表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，2周及4周時(shí)pSmad3表達(dá)水平增高，有顯著性差異(P＜0.05);對(duì)照組中在1周、2周、4周時(shí)pERK1/2/

16、ERK1/2灰度值比值分別為15.33％、13.86％、9.51％，骨髓炎組中在1周、2周、4周時(shí)pERK1/2/ERK1/2灰度值比值分別為16.37％、51.29％、49.30％。骨髓炎組與對(duì)照組相比，1周時(shí)pERK1/2表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，2周及4周時(shí)pERK1/2表達(dá)水平增高，有顯著性差異(P＜0.05);對(duì)照組中在1周、2周、4周時(shí)CollagenⅠ/GAPDH灰度值比值分別為39.48％、33.51％、31.6

17、9％，骨髓炎組中在1周、2周、4周時(shí)CollagenⅠ/GAPDH灰度值比值分別為43.90％、15.54％、19.55％。骨髓炎組與對(duì)照組相比，1周時(shí)Collagen1表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，2周及4周時(shí)CollagenⅠ表達(dá)水平增高，有顯著性差異(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論
　　(1)骨髓炎周圍軟組織瘢痕化在術(shù)后14天出現(xiàn)，至術(shù)后28天瘢痕化程度逐漸增強(qiáng)。
　　(2)骨髓炎動(dòng)物模型中，TGF-β1/S

18、mad信號(hào)通路在術(shù)后14天被活化，至術(shù)后28天活化程度持續(xù)增加。
　　(3)骨髓炎動(dòng)物模型中，ERK/MAPK信號(hào)通路在術(shù)后14天被活化，至術(shù)后28天活化程度持續(xù)增加。
　　(4) TGF-β1/Smad信號(hào)通路以及ERK/MAPK信號(hào)通路在骨髓炎周圍軟組織膠原沉積、瘢痕形成中起重要作用。提示這兩條通路可作為抑制骨髓炎周圍瘢痕形成的靶點(diǎn)。
　　第三章抑制TGF-β1/Smad及ERK/MAPK信號(hào)通路對(duì)大鼠骨髓炎軟組織

19、瘢痕形成的影響
　　研究背景
　　TGF-β1能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖與分化，這一過(guò)程主要由TGF-β1/Smad信號(hào)通路將細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相應(yīng)的效應(yīng)基因?qū)崿F(xiàn)。在經(jīng)典的TGF-β1/Smad信號(hào)通路中，TGF-β1首先與細(xì)胞膜上的TβRⅠ、Tβ RⅡ受體相結(jié)合，結(jié)合復(fù)合體將細(xì)胞漿中Smad2、Smad3活化，從而與Smad4相結(jié)合、轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄。除經(jīng)典的TGF-β1/Smad細(xì)胞信號(hào)通路，TGF-β1也

20、介導(dǎo)非Smad依賴的信號(hào)通路，如通過(guò)激化Ras/Raf/MEK/ERK，最終激活ERK，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致纖維細(xì)胞增殖。除TGF-β1介導(dǎo)兩條單獨(dú)的信號(hào)通路外，ERK與Smad也存在交叉對(duì)話，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能變化，兩者之間的串話，主要經(jīng)Smad2、Smad3連接區(qū)的磷酸化位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)。在不同的細(xì)胞，ERK與Smad之間的串話，表現(xiàn)出抑制或促進(jìn)細(xì)胞增殖的不同的生物學(xué)效應(yīng)。目前，在骨髓炎周圍軟組織瘢痕形成的研究中，阻斷TGF-β1/Smad

21、與ERK/MAPK兩條信號(hào)通路能否減輕軟組織瘢痕化，以及ERK與Smad之間的串話對(duì)瘢痕形成產(chǎn)生怎樣的影響，仍然未被闡明。
　　研究目的
　　1.在大鼠骨髓炎動(dòng)物模型中阻斷TGF-β1，研究阻斷其介導(dǎo)的TGF-β1/Smad信號(hào)通路及ERK/MAPK信號(hào)通路，對(duì)骨髓炎周圍軟組織瘢痕形成的影響。
　　2.阻斷ERK1/2，探討ERK1/2與Smad2/3之間的串話，對(duì)大鼠骨髓炎周圍軟組織瘢痕形成的影響。
　　研究方

22、法
　　1.20只wistar大鼠分為兩組，A組為Decorin處理組，B組為骨髓炎模型組，每組10只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。根據(jù)取材時(shí)間A、B兩組各分為A1-2以及B1-2個(gè)亞組。骨髓炎模型組根據(jù)第一章模型制作方法，利用金黃色葡萄球菌制作大鼠骨髓炎動(dòng)物模型。Decorin處理組于術(shù)后1，3，5天通過(guò)1ml注射器于骨髓炎周圍軟組織內(nèi)肌肉注射Decorin50ug。骨髓炎組于術(shù)后1，3，5天于骨髓炎周圍軟組織內(nèi)肌肉注射PBS0.5ml。分別于術(shù)后

23、第14、28天取材。MASSON染色檢測(cè)膠原沉積程度，Westernblot檢測(cè)TGF-β1、Smad2/3、 ERK1/2以及Ⅰ型膠原的表達(dá)變化。
　　2.20只wistar大鼠分為兩組，A組為PD98059處理組，B組為骨髓炎模型組，每組10只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。根據(jù)取材時(shí)間A、B兩組各分為A1-2以及B1-2個(gè)亞組。骨髓炎模型組根據(jù)第一章模型制作方法，利用金黃色葡萄球菌制作大鼠骨髓炎動(dòng)物模型。PD98059處理組于術(shù)后1，3，5天通過(guò)

24、1ml注射器于骨髓炎周圍軟組織內(nèi)肌肉注射PD9805910mg/kg。骨髓炎組于術(shù)后1，3，5天通過(guò)1ml注射器于骨髓炎周圍軟組織內(nèi)肌肉注射PBS0.5ml。分別于術(shù)后第14、28天取材。MASSON染色檢測(cè)膠原沉積程度，Western blot檢測(cè)ERK1/2、Smad2/3以及Ⅰ型膠原的表達(dá)變化。
　　研究結(jié)果
　　1.MASSON染色顯示，Decorin處理組在2周、4周時(shí)膠原容積分?jǐn)?shù)分別為15.55％、39.27％，

25、骨髓炎組膠原容積分?jǐn)?shù)在2周、4周時(shí)分別為48.57％、68.22％，Decorin處理組與骨髓炎組相比，2周及4周時(shí)膠原容積分?jǐn)?shù)有顯著性差異(P＜0.05)。Western blot顯示，Decorin處理組在2周、4周時(shí)TGF-β1/GAPDH灰度值比值分別為1.16％、3.93％，骨髓炎組在2周、4周時(shí)TGF-β1/GAPDH灰度值比值分別為8.57％、15.22％，Decorin處理組與骨髓炎組相比，在2周、4周時(shí)TGF-β1表達(dá)

26、有顯著性差異(P＜0.05); Decorin處理組在2周、4周時(shí)pSmad2/Smad2/3灰度值比值分別為5.26％、4.01％，骨髓炎組在2周、4周時(shí)pSmad2/Smad2/3灰度值比值分別為8.60％、11.68％，Decorin處理組與骨髓炎組相比，在2周、4周時(shí)pSmad2表達(dá)有顯著性差異(P＜0.05);Decorin處理組在2周、4周時(shí)pSmad3/Smad2/3灰度值比值分別為1.04％、2.44％，骨髓炎組在2周、

27、4周時(shí)pSmad3/Smad2/3灰度值比值分別為9.02％、13.65％，Decorin處理組與骨髓炎組相比，在2周、4周時(shí)pSmad3表達(dá)有顯著性差異(P＜0.05); Decorin處理組在2周、4周時(shí)pERK1/2/ERK1/2灰度值比值分別為17.94％、14.75％，骨髓炎組在2周、4周時(shí)pERK1/2/ERK1/2灰度值比值分別為48.99％、53.75％，Decorin處理組與骨髓炎組相比，在2周、4周時(shí)pERK1/2表

28、達(dá)有顯著性差異(P＜0.05);Decorin處理組在2周、4周時(shí)CollagenⅠ/ GAPDH灰度值比值分別為5.94％、4.75％，骨髓炎組在2周、4周時(shí)CollagenⅠ/GAPDH灰度值比值分別為15.99％、26.75％，Decorin處理組與骨髓炎組相比，在2周、4周時(shí)CollagenⅠ表達(dá)有顯著性差異(P＜0.05);
　　2.MASSON染色顯示，PD98059處理組在2周、4周時(shí)膠原容積分?jǐn)?shù)分別為21.13％、

29、39.79％，骨髓炎組膠原容積分?jǐn)?shù)在2周、4周時(shí)分別為41.34％、63.61％，PD98059處理組與骨髓炎組相比，2周及4周時(shí)膠原容積分?jǐn)?shù)有顯著性差異(P＜0.05)。Western blot顯示， PD98059處理組在2周、4周時(shí)pERK1/2/ERK1/2灰度值比值分別為9.18％、12.95％，骨髓炎組在2周、4周時(shí)pERK1/2/ERK1/2灰度值比值分別為39.99％、46.54％，PD98059處理組與骨髓炎組相比，在

30、2周、4周時(shí)pERK1/2表達(dá)有顯著性差異(P＜0.05); PD98059處理組在2周、4周時(shí)pSmad2/Smad2/3灰度值比值分別為3.24％、9.20％，骨髓炎組在2周、4周時(shí)pSmad2/Smad2/3灰度值比值分別為15.31％、21.44％，PD98059處理組與骨髓炎組相比，在2周、4周時(shí)pSmad2表達(dá)有顯著性差異(P＜0.05); PD98059處理組在2周、4周時(shí)pSmad3/Smad2/3灰度值比值分別為0.9

31、6％、2.14％，骨髓炎組在2周、4周時(shí)pSmad3/Smad2/3灰度值比值分別為3.02％、12.35％，PD98059處理組與骨髓炎組相比，在2周、4周時(shí)pSmad3表達(dá)有顯著性差異(P＜0.05); PD98059處理組在2周、4周時(shí)CollagenⅠ/GAPDH灰度值比值分別為4.40％、5.15％，骨髓炎組在2周、4周時(shí)CollagenⅠ/GAPDH灰度值比值分別為11.69％、18.65％，PD98059處理組與骨髓炎組相