雷奈酸鍶通過TGF-β1-Smad通路促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化.pdf

1、研究目的:骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的系統(tǒng)性、全身性骨病。在老年人群及絕經(jīng)后婦女中骨質(zhì)疏松發(fā)病率很高，嚴(yán)重影響了生活質(zhì)量。據(jù)統(tǒng)計(jì)，60歲以上老年人中，患此癥的比例達(dá)60％～80％，骨質(zhì)疏松癥已成為一個(gè)全球性的健康問題，該病的預(yù)防和治療已經(jīng)成為我國(guó)公共衛(wèi)生事業(yè)面臨的嚴(yán)峻問題。目前，用于治療骨質(zhì)疏松的藥物可分為1、抗骨吸收的藥物，如降鈣素、維生素D、雌激素、雙膦酸鹽等。2、增加骨形成的藥物，如

2、氟化物、甲狀旁腺激素等。3、具有促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收雙重作用的藥物，雷奈酸鍶（strontium ranelate）。由于雷奈酸鍶在抑制骨吸收的同時(shí)促進(jìn)骨的形成，因此，比起傳統(tǒng)的治療骨質(zhì)疏松癥藥物，雷奈酸鍶在影響骨代謝方面具有雙重作用，鍶鹽代表了在骨質(zhì)疏松癥治療史上一個(gè)新的發(fā)展方向。目前對(duì)其在抗骨質(zhì)疏松癥方面的研究已成為熱點(diǎn)。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一種多潛能成體干細(xì)胞，具有向成骨細(xì)胞分化的能力。在BMSCs向

3、成骨細(xì)胞分化中，受到多種信號(hào)通路調(diào)控，其中TGF-β（研究轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1，transforming growth factorβ1）、BMPs（骨形態(tài)發(fā)生蛋白，bone morphogenetic proteins）、Wnt、MAPK（絲裂原活化蛋白激酶，mitogen-activated protein kinase）和Hedgehog（刺猬蛋白信號(hào)通路）信號(hào)通路發(fā)揮了重要作用。TGF-β在骨形成和骨吸收中的平衡方面起重要作用，可促

4、進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化，抑制其向破骨細(xì)胞分化，它在骨重建過程中的作用逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)。Smads蛋白直接參與TGF-β超家族成員的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，它作為TGF-β下游的信號(hào)蛋白分子，將TGF-β信號(hào)從細(xì)胞外轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)，是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的始動(dòng)因子。Runx2又稱為核心結(jié)合因子α1（Cbfα1），是一種多功能轉(zhuǎn)錄因子蛋白，在成骨細(xì)胞的分化和骨形成方面起重要的作用，TGF-β、BMP-2等多種因子可作為Runx2的上游調(diào)

5、節(jié)因子調(diào)節(jié)Runx2的活性。
　　 前期研究已經(jīng)證實(shí)Sr可通過上調(diào)TGF-β1和Runx2表達(dá)來促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化[8]。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步闡明Sr是否通過TGF-β1/Smad信號(hào)通路誘導(dǎo)BMSCs向成骨分化。
　　 1.材料與研究方法
　　 1.1、BMSCs的獲取取四周齡SD大鼠頸推脫臼處死，75％乙醇浸泡5-10min，無菌操作下取雙側(cè)股骨和脛骨，剪去干垢端，用無菌注射器吸取含有

6、10％胎牛血清、100 U/ml青霉素G和100 mg/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔得到骨髓細(xì)胞懸液，并移至15 ml離心管;1000 r/min，5 min離心，制成單細(xì)胞懸液，以1-3(×)105 cells/cm2接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng);24h后半量換液，以后每2-3d換液一次;倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，至細(xì)胞融合至80％時(shí)進(jìn)行傳代，此后每隔3-4d傳代一次。
　　

7、 1.2、BMSCs的成骨誘導(dǎo)選取第3-5代BMSCs，將細(xì)胞種植于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后加入成骨誘導(dǎo)液（含10％胎牛血清、100 U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素、10-8mol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50μg/ml抗壞血酸的DMEM/F12培養(yǎng)基）培養(yǎng)。
　　 1.3、Western blotting法檢測(cè)p-Smad2、Smad2和Runx2蛋白的表達(dá)水平選取第3代細(xì)胞，接種于60m

8、m培養(yǎng)皿中，收集細(xì)胞時(shí)，先用預(yù)冷的PBS洗2遍，加入細(xì)胞裂解液，4℃裂解20-30min，在冰上用預(yù)冷的細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下移至1.5ml EP管中，12000 r/min離心10min，取上清液移至新的EP管中。應(yīng)用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。經(jīng)SDS-PAGE垂直凝膠電泳分離后，9V30min轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5％脫脂奶粉室溫封閉1h后分別加入p-Smad2抗體(1∶1500)、Runx2抗體(1∶500)及GAP

9、DH(1∶5000)，4℃搖床孵育過夜，TBS/T5min洗3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2500)孵育1h，之后TBS/T5min洗3次，最后用發(fā)光試劑ECL顯色，曝光，曝光后用TBST洗膜2-3h，加入Smad2(1∶1000)抗體。用Smartview軟件分析目標(biāo)條帶灰度值，與內(nèi)參Actin條帶灰度值校正后進(jìn)行半定量分析。
　　 1.4、小干擾技術(shù)設(shè)計(jì)3條Smad2特異性siRNA及1條陰性siRNA。操作時(shí)帶手

10、套，使用去RNA酶的槍頭、EP管、試劑。瞬時(shí)離心后，用滅菌ddH2O將siRNA凍干粉配成20μM儲(chǔ)存液，分裝保存，避免反復(fù)凍融。轉(zhuǎn)染前一天，接種適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞至培養(yǎng)板或皿中，用不含雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，置于37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中過夜，使轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度達(dá)60％-70％。轉(zhuǎn)染時(shí)先制備siRNA-Lipo2000混合液:先用不含血清的培養(yǎng)基Opti-MEM分別稀釋siRNA儲(chǔ)存液、Lipo2000，分別輕輕混勻，室溫放置5min后，

11、將兩種混合液輕輕混勻，室溫下孵育20min，將siRNA-Lipo2000混合液加入不含雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)基中，混勻。6h后棄去混合液，更換新鮮不含雙抗的培養(yǎng)基，培養(yǎng)2-3d后進(jìn)行加藥處理.
　　 1.5、real-time PCR法Smad2、Runx2基因的表達(dá)選取第3代培養(yǎng)細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)為1×105/ml接種于25mm培養(yǎng)皿，每皿接種細(xì)胞懸液1mL，各實(shí)驗(yàn)組給予不同的處理因素后，分別于不同時(shí)間點(diǎn)提取細(xì)胞RNA進(jìn)行基因表達(dá)的檢

12、測(cè)。
　　 1.6、ALP活性的檢測(cè)選取第3-5代BMSCs接種于24孔板，各實(shí)驗(yàn)組給予不同處理因素后，在第7d采用酶標(biāo)法檢測(cè)ALP活性。檢測(cè)時(shí)將細(xì)胞收集后以0.2％ TritonX-100裂解液裂解，裂解后用PBS洗2遍，12000 r/min離心10min，取上清液按試劑盒說明書進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)處測(cè)定結(jié)果。
　　 1.7、茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色選取第3代BMSCs，接種于24mm×24mm六孔板中，六孔板

13、底部預(yù)先置入消毒過的載玻片。各組給予相應(yīng)處理因素后，于第21天對(duì)樣本進(jìn)行固定、染色及澄清處理。以上各步驟嚴(yán)格按照細(xì)胞茜素紅鈣染色試劑盒說明書進(jìn)行。倒置顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)染色并拍照，每組取4個(gè)樣本，每樣本隨機(jī)取1個(gè)視野(×100)，比較各組間的差異。
　　 1.8、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理全部結(jié)果以(x)±s表示，經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗(yàn)，各組經(jīng)Levene方差齊

14、性檢驗(yàn)，方差齊，進(jìn)一步多重比較用LSD檢驗(yàn)，方差不齊，運(yùn)用Welch校正法進(jìn)行分析，進(jìn)一步用Dunnett T3比較法進(jìn)行多重組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.研究結(jié)果
　　 2.1、Sr上調(diào)p-Smad2表達(dá)用0.1 mmol/L、1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L和10 mmol/L Sr分別處理BMSCs1h后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)P-Smad2表達(dá)均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0

15、.01)，各組間P-Smad2表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1261.798，P＜0.01);其中當(dāng)Sr濃度為1mmol/L時(shí)，p-Smad2的表達(dá)水平的均數(shù)最大，與其余各組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，可以認(rèn)為當(dāng)Sr濃度為1mmol/L時(shí)，p-Smad2的表達(dá)達(dá)到峰值，當(dāng)Sr濃度為3mol/L、5mol/L和10mol/L時(shí)，p-Smad2的表達(dá)呈逐漸減少趨勢(shì)，但仍高于對(duì)照組(P＜0.01)。用1 mmol/L Sr分別處理rB

16、MSCs15 min、30 min、60 min、120min和360min，與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)P-Smad2表達(dá)均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，各組間P-Smad2表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=723.554，P＜0.01)，其中當(dāng)Sr作用時(shí)間為60min時(shí)p-Smad2的表達(dá)水平的均數(shù)最大，與其余各組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，可以認(rèn)為當(dāng)Sr作用時(shí)間為60min時(shí)，p-Smad2的表達(dá)達(dá)到峰值，Sr作用時(shí)間為1

17、20min和360min時(shí)p-Smad2的表達(dá)水平呈逐漸減小趨勢(shì)，但仍高于對(duì)照組(P＜0.01)。
　　 2.2、Sr上調(diào)Runx2表達(dá)用1 mmol/L Sr分別處理rBMSCs1d、3d、5d和7d，與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)Runx2表達(dá)均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，各組間Runx2表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.106，P＜0.01)，其中當(dāng)Sr作用時(shí)間為5d時(shí)Runx2的表達(dá)水平的均數(shù)最大，與其余各組相比差異均

18、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，可以認(rèn)為當(dāng)Sr作用時(shí)間為5d時(shí)，Runx2的表達(dá)達(dá)到峰值，Sr作用時(shí)間為7d時(shí)Runx2的表達(dá)水平較第5d有所減少，但仍高于對(duì)照組(P＜0.01)。
　　 2.3、TGF-β1阻斷劑拮抗Sr對(duì)p-Smad2表達(dá)的上調(diào)作用用1 mmol/L Sr處理BMSCs1h后，與對(duì)照組相比，p-Smad2表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);用TGF-β1特異性阻斷劑SB431542預(yù)處理BMSCs1

19、h后，再用Sr處理BMSCs1h，細(xì)胞內(nèi)p-Smad2的表達(dá)較單純Sr處理組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 2.4、Smad2 siRNA有效鏈的篩選設(shè)計(jì)三條Smad2小干擾RNA siRNA001、siRNA002、siRNA003，分別轉(zhuǎn)染BMSCs后，再用成骨誘導(dǎo)液處理細(xì)胞，與空白對(duì)照組相比較，小干擾組中Smad2蛋白（Western blotting法）、Smad2 mRNA(Real Time PC

20、R)的表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，其中Smad2 siRNA003轉(zhuǎn)染組Smad2蛋白(Westernblotting法)、Smad2 mRNA(Real Time PCR)表達(dá)的均數(shù)水平最小，與siRNA001、siRNA002組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，可認(rèn)為Smad2 siRNA003干擾Smad2蛋白的表達(dá)的作用最強(qiáng)。
　　 2.5、Smad2 siRNA抑制Sr誘導(dǎo)p-Smad2表達(dá)的上調(diào)

21、用1mmol/L Sr處理BMSCs1h，與對(duì)照組相比，p-Smad2表達(dá)水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，Smad2 siRNA轉(zhuǎn)染BMSCs后，再予以1mmol/LSr處理細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)p-Smad2的表達(dá)較Sr組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 2.6、Smad2 siRNA抑制Sr誘導(dǎo)Runx2表達(dá)的上調(diào)。
　　 用1mmol/L Sr處理BMSCs1h，與對(duì)照組相比，Runx2蛋白(W

22、estern blotting法）、Runx2mRNA(Real Time PCR)表達(dá)水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，Smad2 siRNA轉(zhuǎn)染BMSCs后，再予以1mmol/L Sr處理細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)Runx2蛋白（Western blotting法）、Runx2mRNA(Real Time PCR)的表達(dá)較Sr組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 2.7、Smad2 siRNA抑制Sr誘導(dǎo)ALP活

23、性的增加用1 mmol/L Sr處理BMSCs7d，與對(duì)照組相比，ALP活性明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01); Smad2 siRNA轉(zhuǎn)染rBMSCs后，再用1 mmol/L Sr處理BMSCs7d，與Sr處理組相比，Sr對(duì)ALP活性的促進(jìn)作用受到明顯抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 2.8、Smad2 siRNA抑制Sr誘導(dǎo)鈣結(jié)節(jié)數(shù)量的增多用1 mmol/L Sr處理BMSCs21d，與對(duì)照組相比，鈣結(jié)

24、節(jié)的數(shù)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，Smad2 siRNA轉(zhuǎn)染rBMSCs后，再用1 mmol/L Sr處理BMSCs21d，與Sr處理組相比，鈣結(jié)節(jié)增加數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 3.結(jié)論
　　 (1)在Sr誘導(dǎo)BMSCs分化為成骨細(xì)胞過程中，Sr上調(diào)了p-Smad2、Runx2的表達(dá)。
　　 (2) TGF-β1特異性阻斷劑SB431542拮抗Sr對(duì)P-Smad2表