PARP-1介導(dǎo)原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎中軟骨細(xì)胞TGF-β1-Smad通路失衡的機(jī)制探究.pdf

1、1.背景
　　骨關(guān)節(jié)炎是關(guān)節(jié)炎中最常見的一種類型，是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性病變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生為表現(xiàn)的慢性關(guān)節(jié)疾病，多見于中老年人群。骨關(guān)節(jié)炎可發(fā)病于負(fù)重較大的膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)、脊柱以及指間關(guān)節(jié)等部位。骨關(guān)節(jié)炎通常分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類。繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎通常由先天性畸形、創(chuàng)傷、關(guān)節(jié)不穩(wěn)定等原因?qū)е玛P(guān)節(jié)局部在病變的基礎(chǔ)上發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎。而原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎并沒(méi)有明確發(fā)病原因，多見于50歲以上的中老年人。
　　轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transfo

2、rming growth factor，TGF)-β1是一種重要的細(xì)胞因子，可激活體內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)細(xì)胞功能進(jìn)行調(diào)控，其中以TGF-β1/Smads通路最為重要。TGF-β1與細(xì)胞表面Ⅰ、Ⅱ型受體復(fù)合物(TGF-βR)結(jié)合，活化的Ⅰ型受體與胞漿中Smad-2/3結(jié)合，使之磷酸化而激活，再通過(guò)Smad-4將信號(hào)傳遞至細(xì)胞核，活化核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控靶基因的表達(dá)。上述過(guò)程中，TGF-βR起著的非常重要的作用，直接影響到該信號(hào)通路發(fā)揮后續(xù)的一

3、系列生物學(xué)效應(yīng)。TGF-βR有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三種形式，分子量分別為53kDa、70～85kDa和250～350kDa。Ⅰ和Ⅱ型TGF-βR為糖蛋白，它們與TGF-β1的親和力較與TGF-β2的親和力大10～80倍;Ⅲ型受體為蛋白聚糖(proteoglycan)，它與TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3的親和力近似。TGF-β1/Smads通過(guò)正負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路實(shí)現(xiàn)自我調(diào)控，一方面TGF-β1通過(guò)Smads激活核內(nèi)TGF-β1啟動(dòng)子，自我

4、誘導(dǎo)內(nèi)源性TGF-β1表達(dá)，使細(xì)胞自分泌TGF-β1，并上調(diào)Ⅰ、Ⅱ型受體的表達(dá)，通過(guò)Smads通路放大信號(hào)，形成正反饋環(huán)路;另一方面TGF-β1還通過(guò)Smads激活核內(nèi)Smad-7啟動(dòng)子，瞬時(shí)上調(diào)Smad-7表達(dá)，Smad-7競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合活化的Ⅰ型受體，通過(guò)阻止Smad-2/3磷酸化抑制TGF-β1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，形成負(fù)反饋環(huán)路。有報(bào)道顯示TGF-β1/Smad信號(hào)通路在原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中起到了重要的作用。
　　二磷酸腺苷核糖多

5、聚酶-1(poly(ADP-ribose) polymerase-1，PARP-1）[poly(ADP-ribose) polymerase-1，PARP-1]是存在于真核細(xì)胞中催化聚ADP核糖化的細(xì)胞核酶，他參與的聚ADP核糖化是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)翻譯后的重要修飾方式之一。PARP-1具有幾個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域，其能夠被一些如胱天蛋白酶，鈣蛋白酶，組織蛋白酶，顆粒酶和MMPs等蛋白酶切割，導(dǎo)致介導(dǎo)細(xì)胞死亡的結(jié)構(gòu)域暴露使細(xì)胞發(fā)生凋亡和損傷后的修

6、復(fù)，是細(xì)胞損傷后的一個(gè)重要感受器。此外，PARP-1能夠參與蛋白質(zhì)的翻譯調(diào)控，有研究發(fā)現(xiàn)，PARP-1參與了TGF-β1信號(hào)通路的調(diào)控包括Smad介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和TGF-β的表達(dá)。
　　研究表明PARP-1與TGF-β1/Smad信號(hào)通路之間有著密切的關(guān)系，但由于TGF-β1/Smad信號(hào)通路的復(fù)雜性，PARP-1對(duì)其的作用機(jī)制也較為復(fù)雜，目前尚無(wú)定論。
　　2.目的
　　2.1探討PARP-1在原發(fā)性骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中

7、的表達(dá)，以及PARP-1的表達(dá)水平與原發(fā)性骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病程度的相關(guān)性。
　　2.2通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探討在軟骨細(xì)胞中PARP-1介導(dǎo)的TGF-β1/Smad信號(hào)通路在原發(fā)性骨性關(guān)節(jié)炎中的分子機(jī)制。
　　2.3通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，探討靶向抑制PARP-1介導(dǎo)的TGF-β1/Smad信號(hào)通路在治療原發(fā)性骨性關(guān)節(jié)炎中的有效性。
　　3.材料和方法
　　3.1載體的構(gòu)建
　　3.1.1 PCR反應(yīng)根據(jù)目的片段序列設(shè)計(jì)特異

8、性引物序列，以cDNA為模板，經(jīng)PCR放大得到目的片段。遵循普通PCR反應(yīng)條件，其中，退火溫度及延伸時(shí)間根據(jù)引物長(zhǎng)度和目的片段大小而調(diào)整。普通Taq PCR酶的擴(kuò)增速度為1kb/min。
　　3.1.2瓊脂糖凝膠電泳凝膠濃度、凝膠大小依DNA樣品序列長(zhǎng)短和樣品多少而定，電泳時(shí)間長(zhǎng)短可根據(jù)樣品序列長(zhǎng)短和凝膠的濃度調(diào)整。
　　3.1.3酶切及連接實(shí)驗(yàn)中所使用的表達(dá)質(zhì)粒為pGL3和pcDNA3.1-eGFP。將所需序列進(jìn)行PCR擴(kuò)

9、增后，前者經(jīng)BamHI、KpnI雙酶切，后者經(jīng)XbaI、EcoRI雙酶切。再由T4 DNA連接酶克隆至相同處理的質(zhì)粒中。
　　3.1.4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及小提質(zhì)粒按操作程序進(jìn)行轉(zhuǎn)化擴(kuò)增，質(zhì)粒小提使用質(zhì)粒小提試劑盒。
　　3.2小鼠原代膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞提取和培養(yǎng)
　　對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞按嚴(yán)格操作程序進(jìn)行提取、傳代、凍存、轉(zhuǎn)染。
　　3.3 RNA的提取
　　總RNA樣品提取使用Trizol法。
　　3.4反轉(zhuǎn)錄

10、>　　將RNA反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，作為PCR的模板。
　　3.5實(shí)時(shí)定量PCR
　　RT-PCR使用SYBR Green qPCR Supermix Real-time PCR試劑盒，在Real-timePCR儀上完成。
　　3.6免疫印跡實(shí)驗(yàn)
　　按照細(xì)胞裂解、SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、成像等程序操作。
　　3.7免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)
　　免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C以3，000 rpm速度離心3 mi

11、n，將瓊脂糖珠離心至管底;將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3～4次;最后加入15μl的2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5分鐘;Western blotting分析。
　　3.8小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型的建立
　　本課題所采用的膝骨關(guān)節(jié)炎模型為小鼠內(nèi)側(cè)半月板不穩(wěn)定模型。
　　3.9小鼠膝關(guān)節(jié)取材
　　取完整膝關(guān)節(jié)標(biāo)本，固定24小時(shí)后可進(jìn)入脫鈣程序。標(biāo)本清洗后，進(jìn)行脫水和透明處理，浸蠟和包埋后標(biāo)本切片。
　　

12、3.10小鼠膝關(guān)節(jié)標(biāo)本石蠟切片蕃紅固綠染色
　　石蠟切片脫蠟和復(fù)水后，石蠟切片蕃紅固綠染色。
　　3.11小鼠膝關(guān)節(jié)標(biāo)本石蠟切片免疫組織化學(xué)染色
　　石蠟切片脫蠟和復(fù)水，免疫組織化學(xué)染色。
　　3.12免疫組織化學(xué)染色
　　小鼠的關(guān)節(jié)軟骨損傷組織學(xué)評(píng)估參考OARSI(Osteoarthrisits ResearchSociety International)推薦方法。處死小鼠后，取下小鼠膝關(guān)節(jié)，按照上述方法

13、固定和脫鈣，然后石蠟包埋。切片時(shí)呈矢狀位從關(guān)節(jié)外側(cè)向內(nèi)切片，每個(gè)標(biāo)本的切片要連續(xù)并橫跨整個(gè)關(guān)節(jié)。每張切片厚度為5μm，連續(xù)切片切10張后，在10張切片中選3張切片撈在1張載玻片上，每個(gè)標(biāo)本共撈十張左右載玻片后蕃紅固綠染色以供軟骨損傷評(píng)分用，中間的切片可撈在載玻片上供免疫組化使用。
　　4.結(jié)果
　　4.1原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎中PARP-1水平升高
　　小鼠原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎的程度隨著鼠齡的增長(zhǎng)而加重;PARP-1與原發(fā)性膝骨

14、關(guān)節(jié)炎的病變程度正相關(guān);創(chuàng)傷性膝骨關(guān)節(jié)炎中PAPR-1表達(dá)不變。
　　4.2原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎中TGF-β1/Smad信號(hào)通路的表達(dá)
　　原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎中p-Smad2/3的活性降低;原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎中p-Smad1/5/8的活性升高。
　　4.3 PARP-1對(duì)TGF-β1/Smad信號(hào)通路的影響和分子機(jī)制
　　4.3.1 siRNA抑制軟骨細(xì)胞中PARP-1的表達(dá)
　　靶向性的siRNA顯著的抑制了PA

15、RP-1的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，降低了其在軟骨細(xì)胞中的含量。
　　4.3.2 PARP-1的下降導(dǎo)致TGF-β1/Smad信號(hào)通路的變化
　　相比于對(duì)照組，當(dāng)軟骨細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染了PARP-1的siRNA之后，p-Smad2/3的表達(dá)水平顯著上升。而通過(guò)檢測(cè)Smad2/3活性的pGL3-(CAGA)12-Luc質(zhì)粒的表達(dá)可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PARP-1表達(dá)量下調(diào)后，Smad2/3對(duì)下游靶基因的調(diào)控作用會(huì)升高，而與之相反的是，p-Smad1/5

16、/8的表達(dá)水平會(huì)隨著PARP-1的降低而降低。
　　4.3.3 PARP-1的下降導(dǎo)致CollagenⅡ和PAI-1的表達(dá)變化
　　當(dāng)PARP-1的表達(dá)被抑制后，軟骨細(xì)胞中的CollagenⅡ和PAI-1的mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著提高。
　　4.3.4 PARP-1的下降導(dǎo)致Smad2/3復(fù)合體多聚化的抑制
　　當(dāng)PARP-1表達(dá)量降低時(shí)，通過(guò)PAC抗體沉淀出的Smad2/3蛋白含量降低，表明Smad2和Sma

17、d3的二磷酸腺苷核糖多聚化程度降低，與之前的報(bào)道結(jié)果一致。
　　4.4 PARP-1在小鼠體內(nèi)對(duì)原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎的作用
　　4.4.1 PARP-1抑制劑對(duì)軟骨細(xì)胞中PARP-1和MMP-13的表達(dá)影響
　　小鼠接受PARP-1抑制劑后，PARP-1的表達(dá)量無(wú)顯著差異，MMP-13的表達(dá)量顯著下降。
　　而對(duì)石蠟切片的免疫組化染色結(jié)果也表明注射抑制劑后，PARP-1的表達(dá)量無(wú)顯著差異，MMP-13在膝關(guān)節(jié)組織中的

18、表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組顯著降低。
　　4.4.2 PARP-1抑制劑導(dǎo)致TGF-β1/Smad信號(hào)通路的變化
　　小鼠接受PARP-1抑制劑后，Smad2和Smad3的活性升高，軟骨細(xì)胞中p-Smad2/3的表達(dá)水平上升;而與之相反的是，p-Smad1/5/8的表達(dá)水平顯著降低。
　　4.4.3 PARP-1抑制劑對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平的影響
　　當(dāng)PARP-1的表達(dá)被抑制后，軟骨細(xì)胞中的CollagenⅡ和

19、PAI-1的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著提高。
　　4.4.4 PARP-1抑制劑緩解骨性關(guān)節(jié)炎病變程度
　　為了評(píng)估膝骨關(guān)節(jié)炎的病變情況，我們對(duì)組織切片進(jìn)行了蕃紅固綠染色，并使用OARSI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)來(lái)進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，在接受PARP-1抑制劑治療的膝關(guān)節(jié)組織中，關(guān)節(jié)炎的病變程度明顯降低，說(shuō)明該治療方法對(duì)緩解膝骨關(guān)節(jié)炎有顯著的效果。
　　5.討論
　　研究表明，PARP-1在原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病和發(fā)展過(guò)程中起到了重要

20、的作用。PARP-1的含量與原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎病變程度正相關(guān)。PARP-1可以通過(guò)與TGF-β1/Smad信號(hào)通路的相互作用調(diào)控其下游基因的表達(dá)，同時(shí)PARP-1也可以直接作用于Smad2/3的復(fù)合體，影響其對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控。在細(xì)胞水平上，抑制PARP-1的表達(dá)后，可以檢測(cè)到p-Smad2/3的表達(dá)升高，以及p-Smad1/5/8的表達(dá)降低。而在小鼠實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)注射PARP-1抑制劑來(lái)可降低膝骨關(guān)節(jié)中MMP-13的表達(dá)，p-Smad2/3