單味中藥骨碎補對兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡作用的實驗研究.pdf

1、目的：骨關(guān)節(jié)炎（OA），是由于多種因素引起的多發(fā)于老年人的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，60歲以上的人群中，50％人群在X線上有骨性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)，其中35％-50％有臨床表現(xiàn)；75歲以上的人群中，80％有骨性關(guān)節(jié)炎癥狀。隨著人口老齡化的進展，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率逐年上升，發(fā)病年齡也有下降趨勢，有資料報道45歲以上人群骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率超過40％。隨著我國步入老齡化人口社會，骨關(guān)節(jié)炎正日漸成為醫(yī)患共同關(guān)注的焦點，為此世界衛(wèi)生組織（WHO）將10月12日定為

2、“世界骨關(guān)節(jié)炎日”，21世紀頭十年為“骨關(guān)節(jié)病十年”。骨性關(guān)節(jié)炎是膝關(guān)節(jié)炎癥中最常見的疾病。膝骨性關(guān)節(jié)炎在老年人群中最為常見，尤其是在肥胖的老年人群。男女均可發(fā)病，女性多于男性。臨床觀察證實，膝骨性關(guān)節(jié)炎患者已普遍擴展到35歲以上人群，嚴重困擾著人們的日常生活與勞動。
　　 骨關(guān)節(jié)炎在中醫(yī)學(xué)中屬于“痹病”，“骨痹”范疇，肝腎不足，筋骨失養(yǎng)是重要發(fā)病機制。骨碎補性味苦、溫，活血續(xù)傷，補腎強骨，為骨傷科要藥，具有一定的改善軟骨細胞功

3、能，推遲軟骨細胞退行性變的作用。
　　 本實驗主要利用細胞、分子生物學(xué)技術(shù)，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、蛋白印跡（Western-blot）等檢測方法，通過軟骨細胞凋亡相關(guān)因子的不同表達，進一步探討OA發(fā)病機制，研究骨碎補作用機理，觀察其對實驗性兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡的影響，并進行了理論分析，為中醫(yī)藥防治膝骨性關(guān)節(jié)炎的實驗與臨床提供理論與實際應(yīng)用的依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 1、實驗動物：成年

4、新西蘭大耳白兔24只，普通級，雌雄不分，重量2-3kg。遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。
　　 2、實驗藥物
　　 2.1骨碎補遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供。水煎濃縮成含生藥濃度1g/ml的藥液備用，共計630ml。
　　 2.2維固力愛爾蘭Rottapharm Ltd，批號：H20040637，規(guī)格：0.25g（以硫酸氨基葡萄糖計），遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供。
　　 3、實驗主要試劑

5、　　 1）Western Blot檢測用Ⅰ抗抗體：鼠抗兔單克隆抗體IL-1、羊抗兔TNF-α、鼠抗兔MMP3、鼠抗兔Bcl-2、羊抗兔BAX、鼠抗兔Caspase-3、羊抗兔β-actin。Ⅱ抗抗體：堿性磷酸酶標記兔抗鼠、兔抗羊抗體。2）內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑：3％過氧化氫溶液。3）封閉用正常小牛血清白蛋白工作液。4）堿性磷酸酶標記的Ⅱ抗工作液。5）濃縮PBS緩沖溶液。6）3，3-氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽（DAB）。7）總RNA提取試劑異硫

6、氰酸胍。8）反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）。9）RNA酶抑制劑。10）dNTP混合液。11）Oligo（dT）15。12）γ-Taq DNA聚合酶。13）目的基因引物。14）瓊脂糖。15）考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒。16）硝酸纖維素膜。17）其他試劑：6×凝膠上樣緩沖液、DNA電泳緩沖液（TBE）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺（Acr）、3％戊二醛溶液、甲醇、顯影液、定影液、丙酮、二甲苯、無水乙醇、甲醛、脫脂奶粉等

7、購于華美公司。
　　 4、實驗主要儀器與設(shè)備
　　 1）OLYMPUS顯微鏡。2）電熱恒溫水箱。3）切片機。4）制冰機。5）小型臺式離心機。6） PCR擴增儀。7）紫外分光光度計。8）電泳儀。9）半干轉(zhuǎn)印儀。10）水平搖床。11）垂直板電泳裝置。12） Chemi Imager5500凝膠電泳成像分析系統(tǒng)。13） HITACHI-7500型透射電鏡。
　　 5、兔膝OA的建立：兔左后肢伸直位管型石膏固定6周得到兔

8、膝OA的模型。
　　 6、動物分組及給藥：新西蘭大耳白兔24只，隨機分為4組?？瞻捉M6只，不造模，不用藥，正常飼料喂養(yǎng)。模型組6只，造模后不用藥，正常飼料喂養(yǎng)。治療組（骨碎補組）6只，造模后灌胃，1次/天，用藥4周。對照組（維固力組）6只，造模后灌胃，1次/天，用藥4周。
　　 7、動物處死及取材：用藥4周后，以耳緣靜脈空氣栓塞法處死各組動物。
　　 8、電鏡觀察：在4℃條件下，置于3％戊二醛固定液中浸泡24小時

9、后，環(huán)氧丙烷透明液脫鈣，用0．1M磷酸緩沖液沖洗3次，再加0.1％四氧化鋨固定60min，去離子水沖洗3次，終止鋨酸反應(yīng)，不同濃度乙醇逐級脫水，以Epon812環(huán)氧樹脂浸透、包埋，硬化后修塊半薄切片，定位后超薄切片，切片厚60nm，醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色透射電鏡觀察并攝片。
　　 9、RT-PCR檢測
　　 1）TRIzol法抽提總RNA。2）RNA濃度和純度測定。3）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。4） PCR擴增：應(yīng)用Bi

10、ometra PCR擴增儀。5）RT-PCR產(chǎn)物電泳及分析定量。
　　 10、Western-blot檢測
　　 1）蛋白的提取。2）蛋白濃度的測定。3）蛋白變性。4）配膠。5）電泳。6）轉(zhuǎn)印。7）封閉。8）一抗孵育。9）二抗孵育。10）清洗。11）顯色。12）Western Blot結(jié)果量化分析：采用FlourChem V2.0凝膠成像分析軟件（America）分析，記錄每條蛋白電泳帶的灰度值，進行定量分析。
　

11、　 11、數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計：采用SPSS13.0軟件包對RT-PCR和Western Blot結(jié)果進行方差分析和Pearson相關(guān)分析，數(shù)據(jù)以均值±標準差表示。P<0．05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、大體形態(tài)觀察：空白組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，略呈淡藍色。模型組軟骨表面呈淡白色，仔細觀察可見有散在小的點狀和條形凹陷。治療組和對照組軟骨表面也呈淡白色或淡黃色，表面尚光滑，但均可見有散在的點狀凹陷。
　　 2、

12、電鏡下超微結(jié)構(gòu)的變化：電鏡下觀察軟骨表面的超微結(jié)構(gòu)空白組表面較為平整，可見有勻稱的細小微孔，覆蓋有點狀分布的白色圓球形凝膠樣物質(zhì)；模型組表面粗糙，凹凸不平，局部出現(xiàn)龜裂樣改變，嚴重者表層脫失，其下的膠原纖維裸露，或者軟骨表面出現(xiàn)裂隙，膠原纖維斷裂；治療組病變相對較輕，表面尚平整，表面覆蓋有較大的圓形凝膠樣物質(zhì)，可見散在鱗屑樣改變，局部有裂隙和小孔形成；對照組軟骨表面欠平整，可見較多的裂隙和小孔和大小不一的淺潰瘍形成，局部表層撕裂剝脫，呈

13、片狀卷起，露出其下的膠原纖維。
　　 軟骨細胞鏡下觀察顯示，空白組細胞結(jié)構(gòu)清楚，細胞膜完整，輪廓清晰，核內(nèi)染色質(zhì)均勻分布。細胞外可見縱橫交錯的膠原纖維。模型組細胞膜溶解，核膜不清，胞質(zhì)消失，可見細胞腫脹，壞死明顯增多。細胞周圍的膠原纖維減少，排列紊亂，有的彼此聚集成團狀或捆狀，并出現(xiàn)交錯現(xiàn)象，有的局部稀疏。治療組核固縮，線粒體溶解，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹；對照組核濃縮，核膜不清，線粒體溶解擴張。治療組與對照組細胞周圍膠原纖維排列欠規(guī)則。

14、r>　　 3、RT-PCR檢測結(jié)果：模型組較空白組的TNF-α mRNA、MMP3mRNA、caspase-3mRNA、BAXmRNA表達水平明顯上升，差異有顯著性；對照組較模型組的TNF-α mRNA、MMP3mRNA、caspase-3mRNA、BAXmRNA表達水平有所下降，差異有顯著性；治療組較模型組的TNF-α mRNA、MMP3mRNA、caspase-3mRNA、BAXmRNA表達水平明顯下降，差異有顯著性；治療組較對照

15、組的TNF-α mRNA、MMP3mRNA、caspase-3mRNA、BAXmRNA表達差異無顯著性。
　　 模型組較空白組的bcl-2mRNA表達水平明顯下降，差異有顯著性；對照組較模型組的bcl-2mRNA表達水平有所上升，差異有顯著性；治療組較模型組的bcl-2mRNA表達水平明顯上升，差異有顯著性；治療組較對照組的bcl-2mRNA表達差異無顯著性。
　　 4、Western blot檢測結(jié)果：模型組較空白組的

16、IL-1、TNF-α、MMP3、caspase-3、BAX蛋白表達水平明顯上升，差異有顯著性；對照組較模型組的IL-1、TNF-α、MMP3、caspase-3、BAX蛋白表達水平有所下降，差異有顯著性；治療組較模型組的IL-1、TNF-α、MMP3、caspase-3、BAX蛋白表達水平明顯下降，差異有顯著性；治療組較對照組的IL-1、TNF-α、MMP3、caspase-3、BAX蛋白表達差異無顯著性。
　　 結(jié)論：

17、　　 1.IL-1、MMP3、TNF-α、caspase-3、BAX、bcl-2等因子與骨關(guān)節(jié)炎病變過程密切相關(guān)。
　　 2.本研究證實了在OA關(guān)節(jié)軟骨中存在IL-1、MMP3、TNF-α、caspase-3、BAXmRNA和蛋白表達增強，bcl-2mRNA和蛋白表達減弱，可能是OA發(fā)病機制的一部分。因此，應(yīng)用各種方法，抑制IL-1、MMP3、TNF-α、caspase-3、BAX的表達，增強bcl-2表達及其生物效應(yīng)，有可能

18、成為治療OA的有效途徑，具有重要的意義。
　　 3.通過RT-PCR、Western-blot檢測，單味中藥骨碎補較好的表達出對IL-1、MMP3、TNF-α、caspase-3、BAX、bcl-2等因子的調(diào)控作用，提示其應(yīng)用對防治OA有重要作用，有必要進一步開展相關(guān)臨床與基礎(chǔ)方面的研究。
　　 4.西藥維固力（硫酸氨基葡萄糖）與單味中藥骨碎補同樣表現(xiàn)出對軟骨細胞凋亡相關(guān)因子的抑制或增強作用，且本組數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)顯示無差異性