臭氧對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:隨著人類平均壽命的延長(zhǎng)以及世界范圍內(nèi)人口老齡化,骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率逐年增高,已成為家庭和社會(huì)的巨大負(fù)擔(dān)；對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制及防治研究,一直是醫(yī)學(xué)界的一個(gè)熱點(diǎn)。
　　 骨關(guān)節(jié)炎的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,目前認(rèn)為是由多種因素相互作用而形成的。治療骨關(guān)節(jié)炎的目標(biāo)就是解除患者疼痛,改善關(guān)節(jié)功能,從而提高其生活質(zhì)量。預(yù)防保健是最簡(jiǎn)便而且有效的方法；其它治療手段如口服藥物、關(guān)節(jié)腔注射等,主要緩解患者的疼痛從而部分恢復(fù)關(guān)節(jié)的功能,病情

2、易反復(fù),也容易產(chǎn)生一定的副作用,增加消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)疾病的風(fēng)險(xiǎn)；目前公認(rèn)較為徹底的治療方法就是人工關(guān)節(jié)置換,但其費(fèi)用昂貴、有一定的使用年限且存在一定的手術(shù)風(fēng)險(xiǎn),并不適合我國(guó)國(guó)情。
　　 臭氧能夠用于治療疼痛,且止痛效果較傳統(tǒng)的激素+局麻藥的效果好,副作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于類固醇激素,所以國(guó)內(nèi)外逐漸將臭氧應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎的治療。在緩解疼痛方面,取得了較好的效果。但在臭氧治療骨關(guān)節(jié)炎的研究上,基礎(chǔ)研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于臨床實(shí)踐,這極大的制約了骨關(guān)節(jié)

3、炎臭氧療法的應(yīng)用及推廣。
　　 目前臭氧療法的相關(guān)研究集中于臭氧在血液中的作用及機(jī)制,尚未涉及臭氧作用于關(guān)節(jié)時(shí)對(duì)軟骨、滑膜細(xì)胞的影響。血液中有強(qiáng)大的緩沖系統(tǒng),也有各種抗氧化物質(zhì),臭氧氧化損傷的可能性較小；而關(guān)節(jié)腔中本來就是低氧環(huán)境,軟骨細(xì)胞沒有直接的血液供應(yīng),因此,直接把臭氧在血液中的作用及其機(jī)制直接生搬硬套過來,顯然是不科學(xué)的。
　　 而且國(guó)內(nèi)外使用臭氧治療骨關(guān)節(jié)炎,各家使用臭氧的濃度、劑量、周期及頻率各不相同。臭氧作

4、為一種強(qiáng)氧化物質(zhì),使用過量必然會(huì)造成組織結(jié)構(gòu)的損傷。那么,臭氧在骨關(guān)節(jié)炎中的作用究竟如何?臨床治療的時(shí)候,應(yīng)該使用怎樣的臭氧濃度?其治療的頻率、頻次應(yīng)該多少,才能既取得良好效果,又能最大程度避免其副作用呢?
　　 目的：
　　 1.研究不同濃度臭氧對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎中軟骨及滑膜的影響及其規(guī)律。
　　 2.研究不同濃度臭氧對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎作用的機(jī)制:通過研究不同濃度臭氧對(duì)炎性介質(zhì)IL-1、TNF-α及MMP-13的影響,

5、來確定其作用途徑和機(jī)制；并探討使用何種濃度的臭氧更適合于兔膝骨關(guān)節(jié)炎的治療。
　　 3.研究不同次數(shù)臭氧注射對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎中軟骨及滑膜的影響,觀察不同次數(shù)的臭氧對(duì)炎性介質(zhì)IL-1、TNF-α及MMP-13的影響及其規(guī)律。
　　 4.研究不同次數(shù)臭氧注射對(duì)兔正常膝關(guān)節(jié)中軟骨及滑膜的影響,并觀察其對(duì)炎性介質(zhì)IL-1、TNF-α及MMP-13的影響,探討臭氧注射是否具有累積效應(yīng)。
　　 5.結(jié)合IL-1β及NF-κB抑

6、制劑,研究臭氧對(duì)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的影響及其機(jī)制。
　　 6.提出臭氧治療兔膝骨關(guān)節(jié)炎的治療方案,為制定臨床骨關(guān)節(jié)炎臭氧療法的標(biāo)準(zhǔn)化治療方案提供更多科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：
　　 (一)不同濃度臭氧對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎的影響
　　 1.動(dòng)物模型建立:
　　 為了不干擾兔膝關(guān)節(jié)的內(nèi)環(huán)境,使用關(guān)節(jié)外造模的方法,即兔膝關(guān)節(jié)屈曲位管形石膏固定術(shù)固定6周,來建立兔膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型。
　　 2.臭氧濃度的確定:

7、
　　 臨床上常用的臭氧濃度最高一般不超過60μg/ml,通常為20μg/ml～40μg/ml。本實(shí)驗(yàn)所用臭氧發(fā)生器為德國(guó)赫美斯臭氧治療儀(Germany Humares公司),其能產(chǎn)生的最大臭氧濃度為55μg/ml,因此,實(shí)驗(yàn)中將臭氧濃度設(shè)為10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml及50μg/ml的等差濃度,以求能更精確的顯示各個(gè)濃度等級(jí)的臭氧對(duì)關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)的影響。
　　 3.動(dòng)物分組:
　

8、　 根據(jù)所使用臭氧濃度的不同,將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為正常組、模型組、純氧組及5個(gè)臭氧組:臭氧10μg/ml組、臭氧20μg/ml組、臭氧30μg/ml組、臭氧40μg/ml組及臭氧50μg/ml組。正常組不予任何干預(yù),模型組僅造模不予其它干預(yù),純氧組造模后在膝關(guān)節(jié)腔中注入醫(yī)用純氧2ml,5個(gè)臭氧組造模后分別在膝關(guān)節(jié)腔中注入相應(yīng)濃度的臭氧2ml,所有注射頻率均為1次/周,共3次。
　　 4.病理切片檢查及Mankin評(píng)分:
　　

9、 軟骨標(biāo)本經(jīng)過脫鈣、石蠟包埋、切片、HE染色后制作成病理切片,根據(jù)Mankin評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)軟骨表面結(jié)構(gòu)、細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞克隆及基質(zhì)染色4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分,每個(gè)指標(biāo)均為0～3分,總分為各個(gè)指標(biāo)得分相加?？偡?分為正常,12分最高,分?jǐn)?shù)越高損傷越嚴(yán)重?；?biāo)本經(jīng)過石蠟包埋、切片、HE染色后制作成病理切片,觀察滑膜組織是否完整、有無增生、是否有炎性細(xì)胞浸入、是否有細(xì)胞凋亡或壞死等,評(píng)價(jià)不同濃度臭氧對(duì)滑膜的影響。
　　 5.軟骨、滑膜組織中I

10、L-1、TNF-α及MMP-13的檢測(cè)使用酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法。已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。分別將IL—1、TNF-α及MMP—13和生物素標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育。洗滌后,加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌,去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,然后加入底物A、B,和酶結(jié)合物同時(shí)作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中IL-1 TNF-α及MM

11、P-13的濃度呈比例關(guān)系,用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。
　　 6.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:
　　 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用SPSS13.0軟件,軟骨Mankin評(píng)分結(jié)果為有序分類變量,使用多個(gè)獨(dú)立樣本比較的Kruskal-Wallis H檢驗(yàn),從總體上分析8組之間有無差別。經(jīng)Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)后,如果8組之間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義則

12、進(jìn)行組間多重比較的Nemenyi檢驗(yàn)。
　　 IL-1、TNF-α及MMP-13的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用one-way ANOVA進(jìn)行分析,多組均數(shù)多重比較方差齊性時(shí)采用Student-Newman-Keuls(SNK)法,方差不齊時(shí)采用Dunnett T3法。不同臭氧濃度與IL-1、TNF-α及MMP-13表達(dá)之間的相關(guān)關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析。
　　 檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05,P≤0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義或有顯著性差

13、異。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。
　　 (二)不同次數(shù)臭氧注射對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎的影響
　　 1.動(dòng)物模型的建立:
　　 新西蘭大白兔僅右側(cè)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行骨關(guān)節(jié)炎造模,動(dòng)物模型建立的方法同上所述。
　　 2.臭氧濃度的確定:
　　 前述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示臭氧作用于兔膝骨關(guān)節(jié)炎的最佳濃度為20μg/ml,所以本實(shí)驗(yàn)部分使用的臭氧濃度為20μg/ml。
　　 3.動(dòng)物分組:
　　 根據(jù)臭

14、氧注射次數(shù)的不同分為4組:0次組、1次組、3次組、5次組,分別接受0次(即僅穿刺不進(jìn)行臭氧注射)、1次、3次及5次臭氧注射。臭氧注射的濃度為20μg/ml,進(jìn)行多次注射時(shí),注射間隔為1周。
　　 4.病理切片檢查及Mankin評(píng)分:
　　 同前所述,制作成切片后從表面結(jié)構(gòu)、細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞克隆及基質(zhì)染色4個(gè)方面進(jìn)行Mankin評(píng)分,0分為正常,12分最高,分?jǐn)?shù)越高軟骨損傷越嚴(yán)重。
　　 5.軟骨、滑膜組織中IL-1

15、、TNF-α及MMP-13的檢測(cè):
　　 同前所述,采用組織勻漿后進(jìn)行ELISA法檢測(cè)。
　　 6.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:
　　 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用SPSS13.0軟件,軟骨Mankin評(píng)分結(jié)果為有序分類變量,使用多個(gè)獨(dú)立樣本比較的Kruskal-Wallis H檢驗(yàn),從總體上分析4組之間有無差別。經(jīng)Kruskal—Wallis H檢驗(yàn)后,如果4組之間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義則進(jìn)行組間多重比較的Nemenyi檢驗(yàn)。
　　 IL

16、-1、TNF-α及MMP-13的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用one—way ANOVA進(jìn)行分析,多組均數(shù)多重比較方差齊性時(shí)采用Student-Newman-Keuls(SNK)法,方差不齊時(shí)采用Dunnett T3法。不同臭氧注射次數(shù)與IL-1、TNF-α及MMP-13表達(dá)之間的相關(guān)關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析。
　　 檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05,P≤0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義或有顯著性差異。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。
　　

17、 (三)不同次數(shù)臭氧對(duì)兔正常膝關(guān)節(jié)的影響
　　 1.動(dòng)物模型的建立:
　　 本實(shí)驗(yàn)部分選用兔正常膝關(guān)節(jié),不需要造模。
　　 2.臭氧濃度的確定:
　　 本實(shí)驗(yàn)部分使用的臭氧濃度為20αg/ml。
　　 3.動(dòng)物分組:
　　 根據(jù)臭氧注射次數(shù)的不同分為4組:0次組、1次組、3次組、5次組,分別接受0次(即僅穿刺不進(jìn)行臭氧注射)、1次、3次及5次臭氧注射。臭氧注射的濃度為20μg/ml,進(jìn)行

18、多次注射時(shí),注射間隔為1周。
　　 4.病理切片檢查及Mankin評(píng)分:
　　 同前所述,制作成切片后從表面結(jié)構(gòu)、細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞克隆及基質(zhì)染色4個(gè)方面進(jìn)行Mankin評(píng)分,0分為正常,12分最高,分?jǐn)?shù)越高軟骨損傷越嚴(yán)重。
　　 5.軟骨、滑膜組織中IL-1、TNF-α及MMP-13的檢測(cè):
　　 同前所述,采用組織勻漿后進(jìn)行ELISA法檢測(cè)。
　　 6.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:
　　 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用S

19、PSS13.0軟件,軟骨Mankin評(píng)分結(jié)果為有序分類變量,使用多個(gè)獨(dú)立樣本比較的Kruskal-Wallis H檢驗(yàn),從總體上分析4組之間有無差別。經(jīng)Kruskal—Wallis H檢驗(yàn)后,如果4組之間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義則進(jìn)行組間多重比較的Nemenyi檢驗(yàn)。
　　 IL-1、TNF-α及MMP-13的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用one-way ANOVA進(jìn)行分析,多組均數(shù)多重比較方差齊性時(shí)采用Student-Newman-Keuls(SNK)

20、法,方差不齊時(shí)采用Dunnett T3法。不同臭氧注射次數(shù)與IL-1、TNF-α及MMP-13表達(dá)之間的相關(guān)關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析。
　　 檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05,P≤0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義或有顯著性差異。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。
　　 (四)臭氧對(duì)兔軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的影響
　　 1.軟骨細(xì)胞的取材、分離及培養(yǎng)取體重2～2.5kg的新西蘭大白兔(雌雄不限),耳緣靜脈注射空氣處死,常規(guī)備皮

21、、消毒、鋪巾,無菌條件下剪開皮膚,咬骨鉗取出關(guān)節(jié),無菌手術(shù)刀片削取厚度約0.1～0.2mm的軟骨,放入盛有PBS液的培養(yǎng)皿中,剪碎,移入25ml培養(yǎng)瓶中,用PBS液清洗軟骨塊兩次,去除殘余血跡,加入0.1％Ⅱ型膠原酶2ml消化20分鐘,輕輕吹打后棄去上清,并重復(fù)1次；再加入0.1％Ⅱ型膠原酶5ml,37℃下震蕩消化6～8小時(shí),1500r/min離心3分鐘使細(xì)胞沉淀,棄消化液后清,用培養(yǎng)液清洗三次,以洗去細(xì)胞表面的消化酶；重懸成細(xì)胞混懸液

22、。無菌200目濾網(wǎng)過濾細(xì)胞混懸液后,計(jì)數(shù)。
　　 按5×105/孔的密度將細(xì)胞混懸液接種于6孔板中,培養(yǎng)液選用低糖DMEM、20％胎牛血清、1％(v/v)雙抗、0.69mM抗壞血酸及2mM左旋谷氨酰胺,緩沖液選用HEPES。將6孔板置于PCO25％的孵箱中培養(yǎng)72小時(shí)。顯微鏡下顯示大部分細(xì)胞貼壁牢固并且生長(zhǎng)成亞融合狀態(tài)后,給予干預(yù)。
　　 2.實(shí)驗(yàn)分組:
　　 試驗(yàn)分成A-F六組:其中A表示空白對(duì)照組(norma

23、l),B代表NF-κB抑制劑組(NF-Ⅰ),C表示臭氧組(O3),D表示IL-1β組(IL),E表示IL—1β+NF-κB抑制劑組(IL+NF-Ⅰ),F表示IL-1β+臭氧組(IL+O3)。每組樣本量為5個(gè)。
　　 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,使用臭氧濃度為20μg/ml,加入臭氧的量為0.5ml,即每個(gè)培養(yǎng)孔加入的臭氧劑量為10μg。NF-κB抑制劑的濃度稀釋為100μg/ml,每孔加入100μL,即10μg/孔。IL—1β的濃度為10

24、0ng/ml,每孔加入100μL,即10ng/孔。
　　 3.干預(yù)及不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)液的獲取將6孔培養(yǎng)板置于PCO25％的孵箱中培養(yǎng)72小時(shí)。顯微鏡下顯示大部分細(xì)胞貼壁牢固并且生長(zhǎng)成亞融合狀態(tài)后,準(zhǔn)備給予干預(yù)。首先棄6孔培養(yǎng)板中原有培養(yǎng)液,并在每個(gè)孔中添加1000μL新培養(yǎng)液,在B組、E組對(duì)應(yīng)培養(yǎng)孔中添加濃度為100μg/ml的NF-κB抑制劑100μL,在D組、E組、F組對(duì)應(yīng)培養(yǎng)孔中添加濃度為100ng/m的IL-1β100μL

25、；隨后將每個(gè)培養(yǎng)孔中培養(yǎng)液的總量添加至2000μL；接著在C組、F組對(duì)應(yīng)孔中注射濃度為20μg/ml的臭氧0.5ml,從獲取臭氧到注射之間的間隔控制在15s以內(nèi),整個(gè)注射的過程不少于1min,且注射器針頭始終處于相應(yīng)培養(yǎng)孔培養(yǎng)液的下方。
　　 所有干預(yù)完成后,在5分鐘內(nèi)每個(gè)孔取500μL的培養(yǎng)液,置于凍存管中-20℃保存；24h后每個(gè)孔再取500μL的培養(yǎng)液,同樣置于凍存管中-20℃保存；48h后,將個(gè)孔剩余培養(yǎng)液置于凍存管中-

26、20℃保存。同時(shí)更換新培養(yǎng)液,不再予以其它干預(yù),軟骨細(xì)胞待檢測(cè)。
　　 4.觀察內(nèi)容和檢測(cè)指標(biāo)檢測(cè)0h、24h、48h三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)各組上清液中T-SOD、MDA、NO、iNOS的含量,采用免疫組化方法觀察各組軟骨細(xì)胞NF—κB、COX-2的表達(dá),WesternBlot檢測(cè)軟骨細(xì)胞NF-κB的表達(dá),流式檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞的凋亡情況。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,培養(yǎng)液T-SOD、MDA、iNOS、N

27、O不同時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)使用重復(fù)測(cè)量方差分析,其它數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(One—WayANOVA),若經(jīng)Levene檢驗(yàn),數(shù)據(jù)滿足方差齊性,用SNK法對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較；數(shù)據(jù)不滿足方差齊性,則采用方差分析的近似方法Dunnett T3法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果用:(x)±s表示,p<0.05表示有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 1.不同濃度的臭氧對(duì)軟骨的作用各異,濃度與效應(yīng)有相關(guān)性在實(shí)驗(yàn)中可觀察到,不同濃度的臭氧可加重或減輕

28、兔膝骨關(guān)節(jié)炎中軟骨的損傷。軟骨損傷程度的判斷通常使用Mankin評(píng)分,0分為正常,分?jǐn)?shù)越高損傷越嚴(yán)重。各組軟骨細(xì)胞的Mankin評(píng)分由高到低分別為:臭氧50μg/ml組(7.8分)>模型組(6.8分)及純氧組(6.8分)>臭氧40μg/ml組(5.4分)>臭氧30μg/ml組(4.6分)>臭氧10μg/ml組(4.4分)>臭氧20μg/ml組(3.4分)>正常組(0.2分)。提示臭氧濃度從10μg/mt到20μg/ml升高的過程中,減輕

29、骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷的能力增強(qiáng),而在20μg/ml到50μg/ml的范圍內(nèi),隨著臭氧濃度的增高,軟骨細(xì)胞的損傷程度加重,到達(dá)50μg/ml時(shí),其損傷程度高于模型組,這個(gè)時(shí)候不僅不能起到治療的作用,反而加重關(guān)節(jié)軟骨的損傷。
　　 2.臭氧對(duì)滑膜增生有明顯的抑制作用且具有濃度-效應(yīng)相關(guān)性在注射臭氧的組別中,兔膝關(guān)節(jié)滑膜的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于模型組及純氧組,也少于正常組；并且隨臭氧濃度的增加,滑膜減少越來越明顯。提示臭氧能夠抑制滑膜的增生,臭

30、氧的濃度越高,其抑制作用越強(qiáng)。光鏡下,模型組及純氧組的滑膜組織增生明顯,正常組滑膜細(xì)胞數(shù)量、排列正常,而臭氧各組隨著濃度的增加,滑膜細(xì)胞增生程度逐漸減少,滑膜組織完整性逐漸喪失,到40μg/ml及以上濃度時(shí),滑膜細(xì)胞數(shù)量較正常明顯減少,外層滑膜結(jié)構(gòu)完整性喪失。提示越高濃度的臭氧,對(duì)滑膜組織的氧化損傷程度越重。
　　 3.軟骨、滑膜組織中三種炎性介質(zhì)表達(dá)的變化臭氧注射進(jìn)關(guān)節(jié)腔以后,能引起軟骨、滑膜組織中IL-1、TNF-α及MMP

31、—13這三種炎性介質(zhì)表達(dá)程度的改變,且其變化趨勢(shì)較一致,在軟骨及滑膜組織中表達(dá)情況也較一致,由高到低均為:臭氧50μg/ml組>純氧組和模型組>臭氧40μg/ml組>臭氧10μg/ml組和臭氧30μg/ml組>臭氧20μg/ml組>正常組。臭氧濃度在10μg/ml～30μg/ml的范圍內(nèi),三種炎性介質(zhì)在軟骨和滑膜中的表達(dá)均呈“U”形分布,在20μg/ml以上時(shí),隨著濃度的增高,三種炎性介質(zhì)的表達(dá)均明顯升高,達(dá)到50μg/ml時(shí),其表達(dá)超

32、過模型組及純氧組(50μg/ml組與模型組及純氧組之間兩兩比較均為P=0.000)。提示濃度為50μg/ml的臭氧可明顯加重關(guān)節(jié)組織的損傷。這與軟骨、滑膜光鏡下的表現(xiàn)一致。
　　 4.不同次數(shù)臭氧對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨及滑膜的影響各異為了觀察臭氧的注射次數(shù)會(huì)對(duì)關(guān)節(jié)造成何種影響,進(jìn)行了不同次數(shù)臭氧對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨、滑膜作用的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同次數(shù)的臭氧注射后,對(duì)軟骨組織的影響各異,Mankin評(píng)分由高到低分別為0次組(6.75

33、分)和5次組(6.75分)>1次組(4.63分)>3次組(3.38分),但1次組和3次組之間比較無顯著性差異(P=0.32)。提示注射臭氧可一定程度上減輕軟骨組織的損傷,但注射次數(shù)大于等于5次時(shí),可能無法起到治療的作用,甚至?xí)又剀浌墙M織的損傷。隨著臭氧注射次數(shù)的增加,滑膜組織的數(shù)量越來越少,5次組的滑膜數(shù)量明顯減少以致獲取有一定的難度。
　　 軟骨、滑膜組織中IL-1、TNF-α及MMP-13這三種炎性介質(zhì)表達(dá)程度的變化趨勢(shì)較

34、一致,在軟骨及滑膜組織中表達(dá)情況也較一致,由高到低均為:0次組>5次組>1次組>3次組。提示注射臭氧的次數(shù)在3次或以內(nèi)時(shí),可在一定程度上減輕兔膝骨關(guān)節(jié)炎的損傷,而當(dāng)注射的次數(shù)達(dá)到或超過5次時(shí),可能不僅得不到治療效果,反而造成關(guān)節(jié)損傷程度的加重。
　　 5.不同次數(shù)臭氧對(duì)兔正常膝關(guān)節(jié)軟骨及滑膜造成影響且存在次數(shù)-效應(yīng)相關(guān)性為了比較不同次數(shù)臭氧關(guān)節(jié)腔注射的安全性,評(píng)價(jià)兩次臭氧注射間隔設(shè)定為1周的合理性,觀察不同次數(shù)臭氧注射對(duì)兔正常膝

35、關(guān)節(jié)軟骨、滑膜的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同次數(shù)的臭氧注射后,對(duì)軟骨組織的影響各異,Mankin評(píng)分由高到低分別為5次組(3.75分)和3次組(2.38分)>1次組(1.38分)>0次組(0.13分)。提示注射20μg/ml的臭氧會(huì)對(duì)正常膝關(guān)節(jié)中的軟骨組織造成一定的損傷,且隨著注射次數(shù)的增加,損傷程度逐漸加重。隨著臭氧注射次數(shù)的增加,滑膜組織的數(shù)量越來越少,5次組的滑膜數(shù)量明顯減少以致獲取有一定的難度。
　　 軟骨、滑膜組織中IL-

36、1、TNF-α及MMP-13這三種炎性介質(zhì)在軟骨及滑膜組織中表達(dá)的趨勢(shì)一致,均隨著注射臭氧次數(shù)的增多而增高。提示在正常關(guān)節(jié)腔中注射濃度為20μg/ml的臭氧,會(huì)對(duì)軟骨、滑膜組織造成一定的損傷,且該損傷具有一定的累積效應(yīng),在注射間隔為1周時(shí),注射的次數(shù)越多,造成的損傷越嚴(yán)重。
　　 6.臭氧對(duì)軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)有影響在IL-1β存在的情況下,NF—κB抑制劑及臭氧均能抑制NF—κB的表達(dá),NF-κB抑制劑的抑制作用明顯強(qiáng)于臭氧；臭氧可

37、以明顯減少由IL-1β引起的軟骨細(xì)胞凋亡及壞死；臭氧可以提高軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中T-SOD的含量、降低MDA的水平,也能在一定程度上降低iNOS及NO的水平。
　　 結(jié)論：
　　 1.較低濃度的臭氧可能可以延緩骨關(guān)節(jié)炎病程的進(jìn)展,而較高濃度的臭氧能加重關(guān)節(jié)的損傷。不同濃度臭氧在同樣進(jìn)行3次關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射時(shí),20μg/ml的臭氧效果最佳。
　　 2.不同次數(shù)臭氧對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨及滑膜的影響各異,注射臭氧的次數(shù)在3次時(shí),

38、能最大程度減輕兔膝骨關(guān)節(jié)炎的損傷,而當(dāng)注射的次數(shù)達(dá)到5次時(shí),反而加重關(guān)節(jié)損傷的程度。在使用臭氧治療骨關(guān)節(jié)炎時(shí),要注意臭氧注射的總次數(shù),必要時(shí)適當(dāng)降低臭氧注射的頻次,以避免加重關(guān)節(jié)的損傷。
　　 3.臭氧注射進(jìn)兔正常膝關(guān)節(jié)時(shí),會(huì)造成一定程度的軟骨、滑膜組織損傷,隨著臭氧注射次數(shù)的增加,損傷加重。臭氧注射進(jìn)關(guān)節(jié)腔后會(huì)在短時(shí)間內(nèi)有一定的累積效應(yīng),使用臭氧治療骨關(guān)節(jié)炎時(shí)應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)兩次治療間的間隔時(shí)間。
　　 4.在IL-1β存在