脫氫表雄酮在兔骨關(guān)節(jié)炎環(huán)境下的代謝及其對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的保護(hù)作用機(jī)制研究.pdf

1、骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis OA)是人類最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)疾病，它是一種以關(guān)節(jié)軟骨的變性和破壞為特征的慢性關(guān)節(jié)炎性疾病，多見(jiàn)于中老年人群。骨關(guān)節(jié)炎的具體發(fā)病機(jī)制不明，給早期的臨床治療帶來(lái)了一定困難。早期的骨性關(guān)節(jié)炎多采用藥物對(duì)癥治療，目前常用的治療OA的藥物主要包括非甾體抗炎藥、硫酸氨基葡萄糖、局部應(yīng)用激素及透明質(zhì)酸等，這些藥物能在一定程度上緩解OA的癥狀，但并不能從根本上緩解OA的進(jìn)展。
　　 目前已有較多的研究證實(shí)雌

2、激素與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有明顯相關(guān)性，對(duì)OA有一定的保護(hù)作用，而我們的一些前期研究則發(fā)現(xiàn)脫氫表雄酮（Dehydroepiandrosterone,DHEA）對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎模型具有明顯的保護(hù)作用。DHEA是一種人類和靈長(zhǎng)類動(dòng)物腎上腺大量分泌的一種性激素前體，最終轉(zhuǎn)化為雄激素或雌激素，目前關(guān)于DHEA的研究涉及很多領(lǐng)域，例如動(dòng)脈粥樣硬化，癌癥，糖尿病，肥胖，老齡化，還有炎性關(guān)節(jié)炎等。雖然我們發(fā)現(xiàn)DHEA對(duì)兔OA具有保護(hù)作用，但其機(jī)制還不明確。目前

3、尚未發(fā)現(xiàn)DHEA的組織受體，并且，在某些物種的外周組織DHEA可轉(zhuǎn)化為雌激素和雄激素。因此，在前期研究的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步研究DHEA對(duì)OA的保護(hù)作用是其直接作用還是通過(guò)代謝為下游激素從而起到保護(hù)作用。
　　 本次研究主要分三部分:一、首先進(jìn)行兔軟骨細(xì)胞培養(yǎng)，加入不同濃度的DHEA進(jìn)行干預(yù)，用白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行刺激，探索DHEA對(duì)兔軟骨細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的基因表達(dá)

4、的影響。我們的研究發(fā)現(xiàn)DHEA可抑制IL-1β介導(dǎo)的MMP-13的基因水平表達(dá);增強(qiáng)TIMP-1的基因水平表達(dá);并提高Ⅱ型膠原的基因水平表達(dá)。二、在第一部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們探索了DHEA在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的局部代謝，并且研究了芳香酶抑制劑和雌激素受體阻滯劑對(duì)軟骨細(xì)胞OA相關(guān)分子表達(dá)的影響。我們發(fā)現(xiàn)兔骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞有局部代謝DHEA的能力，在代謝過(guò)程中出現(xiàn)了明顯的甾體激素合成相關(guān)酶如3β-HSD、17β-HSD、P450的基因表達(dá)，

5、能在局部合成睪酮和雌二醇。在加用了芳香酶抑制劑來(lái)曲唑(Letrozole)和雌激素受體阻滯劑ICI182，780后，MMP-3、MMP-13的表達(dá)水平均升高，兩藥同時(shí)作用時(shí)升高更明顯;Col-Ⅱ、TIMP-1的表達(dá)水平則降低，兩藥同時(shí)作用時(shí)降低更明顯。三、我們?cè)谇懊骟w外研究的基礎(chǔ)上，觀察在ACLT動(dòng)物模型中，通過(guò)關(guān)節(jié)腔注射DHEA以及芳香酶抑制劑來(lái)曲唑和雌激素受體阻滯劑ICI182，780，來(lái)觀察DHEA在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的抗OA作用及是否通

6、過(guò)下游激素起作用。我們發(fā)現(xiàn)來(lái)曲唑通過(guò)影響DHEA轉(zhuǎn)化為雌激素和ICI182，780通過(guò)影響雌激素結(jié)合起作用都影響了DHEA的保護(hù)作用。我們的研究結(jié)果提示DHEA很可能是通過(guò)代謝為下游激素起到對(duì)OA的保護(hù)作用。
　　 第一部分DHEA對(duì)兔軟骨細(xì)胞中MMP-13和TIMP-1表達(dá)的影響
　　 目的:
　　 觀察DHEA對(duì)IL-1β刺激的兔軟骨細(xì)胞MMP-13/TIMP-1、Ⅱ型膠原表達(dá)的影響。
　　 方法:<

7、br>　　 取兔骨關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本，用酶消化法提取軟骨細(xì)胞，并進(jìn)行兔軟骨細(xì)胞培養(yǎng)。取第三代軟骨細(xì)胞，加入不同濃度的DHEA，然后用IL-1β刺激，24小時(shí)后收取細(xì)胞。用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原、MMP-13和TIMP-1的基因表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:
　　 DHEA可抑制兔軟骨細(xì)胞中IL-1β介導(dǎo)的MMP-13的基因表達(dá)，提高軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原、TIMP-1的基因表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 DH

8、EA可抑制IL-1β介導(dǎo)的MMP-13的基因水平表達(dá);增強(qiáng)TIMP-1的基因水平表達(dá);提高Ⅱ型膠原的基因水平表達(dá)。
　　 第二部分DHEA在兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境下的代謝及對(duì)OA保護(hù)作用機(jī)制
　　 目的:
　　 觀察兔OA軟骨細(xì)胞中DHEA的代謝、下游激素水平和其中相關(guān)酶類表達(dá)水平。
　　 方法:
　　 軟骨細(xì)胞用10μM的DHEA預(yù)處理4小時(shí)，然后加入IL-1β(最終濃度10ng/ml)，繼續(xù)孵

9、育，收取0，0.5，1，2，4，6，8，12，24，36，48，60，72小時(shí)的培養(yǎng)基用ELISA法進(jìn)行DHEA、睪酮、雌二醇測(cè)定，收取24小時(shí)軟骨細(xì)胞用Westeren blot檢測(cè)甾體激素合成相關(guān)酶3β-HSD、17β-HSD、P450的蛋白表達(dá)。在觀察來(lái)曲唑抑制實(shí)驗(yàn)中，我們分成五組:A組(DHEA+ IL-1β);B組（DHEA+來(lái)曲唑+ IL-1β）;C組（DHEA+ICI+ IL-1β）;D組(DHEA+來(lái)曲唑+ICI+ IL

10、-1β）;E組（對(duì)照組，單加IL-1β，收取24小時(shí)軟骨細(xì)胞進(jìn)行Westeren blot及PCR檢測(cè)MMP-3，MP-13，TIMP-1和Col-Ⅱ的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞能夠局部利用DHEA，其下游激素睪酮、雌二醇及甾體激素合成相關(guān)酶類3β-HSD、17β-HSD、P450基因均出現(xiàn)明顯升高。在加用了芳香酶抑制劑來(lái)曲唑(Letrozole)和雌激素受體阻滯劑ICI182，780后，MMP-3

11、、MMP-13的表達(dá)水平均升高，兩藥同時(shí)作用時(shí)升高更明顯;Col-Ⅱ、TIMP-1的表達(dá)水平則降低，兩藥同時(shí)作用時(shí)降低更明顯。
　　 結(jié)論:
　　 兔骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞有局部代謝DHEA的能力，能在局部合成睪酮和雌二醇。通過(guò)芳香酶抑制劑來(lái)曲唑和雌激素受體阻滯劑ICI182，780作用軟骨細(xì)胞，能夠降低DHEA對(duì)關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用，說(shuō)明DHEA是通過(guò)下游激素的從而起到對(duì)關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 第三部分

12、DHEA對(duì)兔OA動(dòng)物模型的保護(hù)作用及其代謝對(duì)結(jié)果的影響
　　 目的:
　　 觀察DHEA在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的抗OA作用及是否通過(guò)下游激素起作用。
　　 方法:
　　 取30只新西蘭大白兔，用右膝前交叉韌帶切斷(ACLT)法制作OA模型。術(shù)后隨機(jī)分為5組，每組6只，分別為對(duì)照組（E組），A組，B組，C組，D組。關(guān)節(jié)腔注射從術(shù)后第一天開(kāi)始，每周一次，持續(xù)9周。末次注射后1周取右膝關(guān)節(jié)（股骨側(cè)），進(jìn)行形態(tài)學(xué)、組織學(xué)觀

13、察，并用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨中MMP-13、TIMP-1、Ⅱ型膠原的基因表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 在ACLT動(dòng)物模型中，組織學(xué)評(píng)分提示單加DHEA組的評(píng)分是最高的，加來(lái)曲唑和ICI182，780都使評(píng)分降低了，當(dāng)兩藥同時(shí)作用時(shí)其評(píng)分是最低的。來(lái)曲唑通過(guò)影響DHEA轉(zhuǎn)化為雌激素和ICI182，780通過(guò)影響雌激素起作用都影響了DHEA的保護(hù)作用。
　　 結(jié)論:
　　 DHEA很可能是通過(guò)體內(nèi)代謝為