泛素連接酶Hrd1介導(dǎo)的tau蛋白降解.pdf

1、神經(jīng)細(xì)胞中的tau蛋白異常聚集是許多神經(jīng)退行性疾病共有的病理特征，例如在阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)，進(jìn)行性核上癱(progressivesupranuclear palsy)及第17號(hào)染色體異常導(dǎo)致的額顳葉型癡呆伴巴金森癥(frontotemporal dementia with Parkinsonism linked to chromosome 17，F(xiàn)TDP-17)，這些疾病統(tǒng)稱(chēng)為tau蛋白病(ta

2、uopathy)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)的泛素連接酶Hrd1和tau在AD病人的皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元內(nèi)有共定位。且Hrd1的表達(dá)和異常磷酸化tau的聚集存在負(fù)相關(guān)。我們?cè)诩?xì)胞模型上觀察到Hrd1的表達(dá)可以減少tau的毒性，并發(fā)現(xiàn)該作用與Hrd1能降低tau蛋白總體水平有關(guān)。在上述研究的基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步探討了Hrd1減少細(xì)胞內(nèi)tau蛋白水平的相關(guān)機(jī)制。這不僅有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)Hrd1的功能和tau蛋白病的病理機(jī)制，也為以Hrd1為靶點(diǎn)的藥物

3、設(shè)計(jì)和篩選提供技術(shù)平臺(tái)。 目的：觀察Hrd1能減少細(xì)胞內(nèi)tau蛋白水平是否與其介導(dǎo)tau降解有關(guān)及其降解機(jī)制。 方法：將pEGFP-C1-tau真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒與野生型。Hrd1或酶失活型Hrd1C1A轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，然后用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的水平；同時(shí)用GSK-3 β誘導(dǎo)tau過(guò)度磷酸化，觀察Hrd1過(guò)度磷酸化的tau降解的影響。用CHX示蹤法觀察蛋白質(zhì)的降解；用免疫熒光雙標(biāo)及免疫沉淀法觀

4、察Hrd1和tau的相互作用。 結(jié)果： 1.Hrd1降低細(xì)胞內(nèi)磷酸化及非磷酸化tau的水平采用非神經(jīng)來(lái)源的293T細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染GFP-tau、wtHrd1和Hrd1C1A質(zhì)粒，并用GSK-3 β共轉(zhuǎn)染細(xì)胞以誘導(dǎo)tau蛋白磷酸化。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后16-24 h，共轉(zhuǎn)染Hrd1的細(xì)胞熒光減弱。Western blot結(jié)果顯示：與單獨(dú)轉(zhuǎn)染tau質(zhì)粒的細(xì)胞相比，共轉(zhuǎn)染Hrd1的細(xì)胞內(nèi)磷酸化及非磷酸化tau的水平都明顯減少，而共轉(zhuǎn)

5、染Hrd1C1A則對(duì)細(xì)胞內(nèi)tau的水平?jīng)]有明顯影響。提示，Hrd1能降低細(xì)胞內(nèi)磷酸化及非磷酸化tau的總體水平，這可能是Hrd1減少tau毒性的病因。 2.Hrd1促進(jìn)tau蛋白的降解為了進(jìn)一步觀察tau蛋白的減少是否由于tau降解增加所致，我們?cè)谵D(zhuǎn)染后24 h，在細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中加入放線(xiàn)菌酮(CHX)以阻斷tau的蛋白合成，并于加入CHX后4 h，8 h，16 h分別收取細(xì)胞，用免疫印記分析tau的水平。結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染Hrd

6、1的細(xì)胞，tau蛋白的清除加快。表明Hrd1可以促進(jìn)tau的降解。 3.Hrd1促進(jìn)磷酸化tau蛋白的降解年齡相關(guān)的NFTs的形成具有神經(jīng)毒性，高度磷酸化的tau在這個(gè)過(guò)程中具有重要作用。以前的研究表明泛素連接酶CHIP可以識(shí)別磷酸化的tau蛋白，并且在tau蛋白上加上泛素。我們?cè)?93T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染編碼tau和GSK-3 β的質(zhì)粒來(lái)誘導(dǎo)tau的磷酸化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GSK-3 β磷酸化后tau蛋白的總體水平提高。這個(gè)可能由于tau磷

7、酸化后穩(wěn)定性提高的緣故。當(dāng)共轉(zhuǎn)染Hrd1時(shí)，Hrd1降低了GSK-3 β誘導(dǎo)的磷酸化tau的總量。CHX實(shí)驗(yàn)表明wtHrd1可以促進(jìn)磷酸化tau蛋白的降解。這些結(jié)果表明Hrd1可以促進(jìn)磷酸化tau蛋白的降解。 4.蛋白酶體參與Hrd1介導(dǎo)的tau降解有報(bào)道顯示，蛋白酶體可以降解tau蛋白。為了觀察蛋白酶體是否參與了Hrd1介導(dǎo)的tau蛋白降解，我們?cè)?93T細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染tau或共轉(zhuǎn)染tau和Hrd1，在收取細(xì)胞前4 h，培養(yǎng)液內(nèi)加

8、入蛋白酶體抑制劑MGl32或溶酶體抑制劑氯化銨。結(jié)果表明，蛋白酶體抑制劑MG132可以穩(wěn)定tau蛋白的表達(dá)，而氯化銨不能穩(wěn)定tau的表達(dá)。當(dāng)用N-乙基順丁烯二酰亞胺(NEM)抑制去泛素化后，我們可以觀察到高分子量tau的聚集，這些結(jié)果表明蛋白酶體參與了Hrd1介導(dǎo)的tau蛋白的降解。 5.Hrd1與tau蛋白的相互作用我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，Hrd1可加強(qiáng)胞質(zhì)蛋白帶有擴(kuò)展型多聚谷氨酰胺Huntingtin的降解。Hrd1是否也可以與

9、胞質(zhì)蛋白tau相互作用呢?為了回答這個(gè)問(wèn)題，我們首先進(jìn)行了免疫共沉淀(IP)實(shí)驗(yàn)。在293T細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染tau和Hrd1的質(zhì)粒，24h后收集細(xì)胞并裂解，然后用單克隆抗體tau-5進(jìn)行免疫沉淀細(xì)胞裂解液中的tau蛋白，再用免疫印跡(IB)法檢測(cè)Hrd1是否可以被tau共沉淀下來(lái)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在IP tau時(shí)，同時(shí)把Hrd1共沉淀下來(lái)，而且這種作用是不依賴(lài)于Hrd1的E3活性的。同時(shí)，我們使用免疫熒光雙標(biāo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，Hrd1與tau在細(xì)胞內(nèi)有共定

10、位。提示Hrd1與tau蛋白存在相互作用。 6.Hrd1增強(qiáng)tau的泛素化為了更進(jìn)一步確定Hrd1可以泛素化tau蛋白，我們?cè)?93T細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染編碼Hrd1，His-tau，ubiquitin蛋白的質(zhì)粒。蛋白酶體抑制劑MG132用來(lái)抑制泛素化tau的降解。我們發(fā)現(xiàn)Hrd1的過(guò)表達(dá)可以增加高分子量的tau，當(dāng)用GFP-tau質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，也得到了同樣的結(jié)果。在免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中，抑制蛋白酶體活性后，轉(zhuǎn)染Hrd1質(zhì)粒的細(xì)胞tau的泛

11、素化明顯增強(qiáng)。這些高分子量tau的形成與tau的泛素化有關(guān)。為了了解tau磷酸化對(duì)Hrd1介導(dǎo)的tau泛素化的影響，我們?cè)?93T細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染編碼GSK-3 β的質(zhì)粒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在共轉(zhuǎn)染GSK-3 β的細(xì)胞內(nèi)，高分子量tau蛋白的量顯著增加，提示GSK-3 β誘導(dǎo)的磷酸化可以穩(wěn)定泛素化的tau蛋白。結(jié)論： 以上研究結(jié)果表明，Hrd1可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)過(guò)度表達(dá)的磷酸化和非磷酸化tau的降解，這種作用依賴(lài)其E3活性；泛素-蛋白酶體通路參