人腸上皮細(xì)胞泛素連接酶TRAF6泛素化修飾.pdf

1、沙門氏菌是一種革蘭氏陰性腸道桿菌，感染宿主動(dòng)物后能夠引發(fā)多種疾病。沙門氏菌可以通過多種致病效應(yīng)分子的作用在宿主體內(nèi)定殖、存活、復(fù)制，其中，Ⅲ型分泌系統(tǒng)在沙門氏菌致病過程中發(fā)揮極其重要的作用。該分泌系統(tǒng)能夠分泌60多種效應(yīng)分子進(jìn)入宿主細(xì)胞并發(fā)揮其調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞生物學(xué)過程的功能。SopB是由沙門氏菌SPI-1Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的具有肌醇磷脂酶活性的效應(yīng)蛋白。目前的研究發(fā)現(xiàn)，SopB在沙門氏菌感染宿主細(xì)胞的過程中，其時(shí)間和空間上的精確調(diào)控依賴于其

2、泛素化修飾。基于此，通過體外活性重組技術(shù)，分離到了人腸上皮細(xì)胞泛素化修飾SopB的泛素連接酶TRAF6。
　　 為了進(jìn)一步通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)TRAF6是能夠泛素化修飾沙門氏菌SopB的泛素連接酶，我們首先通過RNA干擾技術(shù)篩選到了TRAF6高效阻斷表達(dá)的Henle-407 shTRAF6細(xì)胞系。此外還利用TRAF6基因缺失的鼠胚成纖維細(xì)胞Traf6-/-做為研究模型，確認(rèn)了TRAF6是人腸上皮細(xì)胞中泛素化修飾SopB的泛素連接酶。

3、基于SopB的泛素化修飾是能夠?qū)opB從細(xì)胞質(zhì)膜定位至沙門氏菌內(nèi)含小泡SCV的關(guān)鍵因素，進(jìn)一步利用激光共聚焦技術(shù)比較了TRAF6對(duì)SopB亞細(xì)胞定位的影響，結(jié)果表明TRAF6的缺失導(dǎo)致SopB從沙門氏菌感染部位擴(kuò)散，而不能與沙門氏菌共定位?；谏鲜鼋Y(jié)果，為了進(jìn)一步研究SopB與TRAF6之間是否存在相互作用，我們利用免疫共沉淀技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)SopB與TRAF6之間能夠共沉淀，進(jìn)而表明兩者之間存在相互作用。TRAF6是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)分子

4、，基于SopB被發(fā)現(xiàn)具有多種功能，包括能夠激活細(xì)胞MAPKs的磷酸化以及Akt的磷酸化等。因此我們進(jìn)一步分析是否SopB的生物學(xué)功能的發(fā)揮依賴于TRAF6的活性。結(jié)果表明：TRAF6部分的介導(dǎo)了受SopB激活的原癌基因Akt的磷酸化。同時(shí)利用shTRAF6細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)TRAF6介導(dǎo)了受沙門氏菌感染以及LPS處理誘導(dǎo)的MAPKs的磷酸化激活。綜上所述，TRAF6泛素化修飾沙門氏菌效應(yīng)分子SopB，并且與之形成復(fù)合物介導(dǎo)了受SopB激活