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文檔簡介
1、目的:
通過運(yùn)用RNA干擾技術(shù)下調(diào)泛素連接酶Ring2基因的表達(dá)水平,探討Ring2在苯并[a]芘致人支氣管上皮細(xì)胞DNA損傷及組蛋白H2A單泛素化中的作用。
方法:
取對數(shù)生長期16HBE細(xì)胞,在RNA干擾泛素連接酶Ring2基因前后,分別進(jìn)行不同濃度B[a]P(0,1,2,4,8,16,32μmol/L)染毒24h;同一濃度(2,8,16μmol/L)B[a]P染毒不同時間(0,1,2,4,
2、8,12,24h)以及同一濃度(2,8,16μmol/L)B[a]P染毒2h后恢復(fù)不同時間(0,1,2,4,8,12,24h)實(shí)驗(yàn),用單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞DNA損傷水平,并以O(shè)live尾距值(Olive Tail Moments,OTM)評價DNA損傷程度;用WESTERN-BLOT法檢測組蛋白H2A單泛素化水平。
結(jié)果:
Ⅰ、RNA干擾前
1、單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果顯示:不同濃度B[a]P染
3、毒24h時,隨著染毒劑量的升高,各組細(xì)胞DNA損傷程度增強(qiáng),且與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);同一濃度(2,8,16μmol/L)B[a]P染毒不同時間時,隨著染毒時間的延長,各組細(xì)胞DNA損傷程度增強(qiáng),且與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);2μmol/LB[a]P染毒2h后恢復(fù)不同時間時,隨著恢復(fù)時間的延長,OTM逐漸下降,且在恢復(fù)2h后,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);8μmol/LB[a]P染毒2h后恢復(fù)不同時間
4、時,與對照組相比,恢復(fù)1h時OTM值略升高,但無顯著性差異,恢復(fù)2h時OTM值開始下降,但無顯著性差異,隨著恢復(fù)時間的延長,各組細(xì)胞OTM值下降明顯,差異有顯著性(P<0.01);16μmol/LB[a]P染毒2h后恢復(fù)不同時間時,與對照組相比,恢復(fù)th時OTM值有顯著性升高(P<0.01),隨著恢復(fù)時間的延長,各組細(xì)胞的OTM值顯著性下降(P<0.01)。
2、WESTERN-BLOT結(jié)果顯示:不同濃度B[a]P染毒24
5、h時,隨著染毒濃度的增高,組蛋白H2A單泛素化表水平增高,且與正常細(xì)胞組相比,各染毒組都有顯著性差異(P<0.01);2μmol/LB[a]P染毒不同時間時,隨著染毒時間的延長,組蛋白H2A單泛素化水平增高明顯,與對照組相比,染毒2h后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);8μmol/LB[a]P染毒不同時間時,隨著染毒時間的延長,組蛋白H2A單泛素化水平增高明顯,與對照組相比,各染毒組差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);16μmol/LB
6、[a]P染毒不同時間時,隨著染毒時間的延長,組蛋白H2A單泛素化水平增高明顯,與對照組相比,染毒4h后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);2μmol/LB[a]P染毒2h后恢復(fù)不同時間時,與對照組相比,各染毒恢復(fù)組細(xì)胞組蛋白H2A泛素化水平增高,差異有顯著性(P<0.01),且在8h處達(dá)到最大值;8μmol/LB[a]P染毒2h后恢復(fù)不同時間時,與對照組相比,各染毒恢復(fù)組細(xì)胞組蛋白H2A泛素化水平增高,差異有顯著性(P<0.01),且在8
7、h處達(dá)到最大值;16μmol/LB[a]P染毒2h后恢復(fù)不同時間時,與對照組(恢復(fù)0h)相比,恢復(fù)th時H2A泛素化水平略有增高,差異無顯著性,恢復(fù)2h時增高明顯(P<0.05),其余各染毒恢復(fù)組H2A泛素化水平增高明顯,差異有顯著性(P<0.01),且在8h處達(dá)到最大值。
3、回歸分析不同濃度的B[a]P染毒細(xì)胞24h組的H2A單泛素化水平(X)與OTM值(Y)有相關(guān)關(guān)系,且相關(guān)的回歸方程符合Cubic模型:Y=5.25
8、1-278.807X2+736.392X3(R2=0.910P<0.01);2μMB[a]P染毒不同時間組的H2A單泛素化水平(X)與OTM值(Y)有相關(guān)關(guān)系,且相關(guān)的回歸方程符合Cubic模型:Y=2.306-38.713X+209.283X2-234.211X3(R2=0.723P<0.05);8μMB[a]P染毒不同時間組的H2A單泛素化水平(X)與OTM值(Y)有相關(guān)關(guān)系,且相關(guān)的回歸方程符合Exponential模型:Y=Ex
9、p(0.085+11.476X)(R2=0.77P<0.01);16μMB[a]P染毒不同時間組的H2A單泛素化水平(X)與OTM值(Y)有相關(guān)關(guān)系,且相關(guān)的回歸方程符合Cubic模型:Y=13.269-169.591X+669.054X2-625.192X3(R2=0.944P<0.01);2μMB[a]P染毒2h后恢復(fù)不同時間組的H2A單泛素化水平(X)與OTM值(Y)有相關(guān)關(guān)系,且相關(guān)的回歸方程符合Linear模型:Y=1.574
10、-2.753X3(R2=0.603P<0.05);8μMB[a]P染毒2h后恢復(fù)不同時間組的H2A單泛素化水平(X)與OTM值(Y)有相關(guān)關(guān)系,且相關(guān)的回歸方程符合Cubic模型:Y=7.353-21.907X+41.582X3(R2=0.503P<0.05);16μMB[a]P染毒2h后恢復(fù)不同時間致組的H2A單泛素化水平(X)與OTM值(Y)有相關(guān)關(guān)系,且相關(guān)的回歸方程符合Cubic模型:Y=6.852_23.601X+58.494
11、X3(R2=0.750P<0.05).
Ⅱ、RNA干擾序列刷選
轉(zhuǎn)染效率及基因沉默效率結(jié)果:16HBE以50nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染6h后,分別培養(yǎng)24h和30h組,與序列對照組相比,各Ring2干擾組Ring2表達(dá)水平降低明顯,且差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),在培養(yǎng)30h時,對Ring2基因的抑制率最高且達(dá)到72%。
Ⅲ、RNA干擾后
1、單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果顯示:不同濃度
12、B[a]P染毒24h時,隨著染毒劑量的升高,各組細(xì)胞DNA損傷程度增強(qiáng),且與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);同一濃度(2,8,16μmol/L)B[a]P染毒不同時間時,隨著染毒時間的延長,各組細(xì)胞DNA損傷程度增強(qiáng),且與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);2μmol/LB[a]P染毒2h后恢復(fù)不同時間時,隨著恢復(fù)時間的延長,OTM逐漸下降,且在恢復(fù)2h后,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);8μmol/LB[a]P染毒2h后
13、恢復(fù)不同時間時,與對照組相比,隨著恢復(fù)時間的延長,各組細(xì)胞OTM值下降明顯,差異有顯著性(P<0.01);16μmnol/LB[a]P染毒2h后恢復(fù)不同時間時,與對照組相比,恢復(fù)2h后各組細(xì)胞的OTM值顯著性下降(P<0.01)。
2、WESTERN-BLOT結(jié)果顯示:不同濃度B[a]P染毒24h時,隨著染毒濃度的增高,組蛋白H2A單泛素化表水平變化不明顯,且與正常細(xì)胞組相比,各染毒組都無顯著性差異;同一濃度(2、8、16
14、μmol/L)B[a]P染毒不同時間時,隨著染毒時間的延長,組蛋白H2A單泛素化水平變化不明顯,與對照組相比,各染毒組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;同一濃度(2、8、16μmol/L)B[a]P染毒2h后恢復(fù)不同時間時,與對照組相比,各染毒恢復(fù)組細(xì)胞組蛋白H2A泛素化水平變化不明顯,各染毒組差異無顯著性。
3、回歸分析顯示,各組H2A單泛素化水平(X)與OTM值(Y)無相關(guān)關(guān)系。
Ⅳ、協(xié)方差分析顯示,在泛素連接酶Ring
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