泛素連接酶RNF168RING結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和功能研究.pdf

1、DNA雙鏈斷裂損傷（DNA double-strand break—DSB）是最為嚴(yán)重的DNA損傷。在人體中，DNA雙鏈損傷如果得不到及時(shí)修復(fù)就會(huì)引發(fā)基因組的不穩(wěn)定性，并誘發(fā)諸如癌癥、免疫缺陷等重大疾病。為了消除DNA雙鏈損傷可能對(duì)基因組完整性造成的惡性影響，細(xì)胞演化出復(fù)雜的分子機(jī)制中止細(xì)胞周期前行并啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)以應(yīng)對(duì)基因毒性壓力。細(xì)胞內(nèi)DNA雙鏈損傷修復(fù)通路的信號(hào)傳導(dǎo)開始于γH2AX依賴的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大，而終止于DNA損傷調(diào)節(jié)蛋白

2、和修復(fù)蛋白在損傷位點(diǎn)的募集。根據(jù)早前報(bào)道，DNA雙鏈損傷信號(hào)通過(guò)一系列翻譯后修飾系統(tǒng)進(jìn)行傳導(dǎo)和放大，最近的一些研究又進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了由泛素連接酶RNF8和RNF168催化的非降解性泛素鏈在此通路中的作用。
　　RING型鋅指蛋白R(shí)NF8通過(guò)N端的FHA結(jié)構(gòu)域識(shí)別并結(jié)合磷酸化的MDC1，從而定位到DNA雙鏈損傷位點(diǎn);通過(guò)C端的RING結(jié)構(gòu)域與泛素結(jié)合酶(E2)Ubc13相互作用，催化H2A型組蛋白的泛素化，并在此基礎(chǔ)上募集RIDDLE綜

3、合征蛋白R(shí)NF168。在目前關(guān)于RNF168的作用機(jī)制模型中，RNF168與泛素結(jié)合酶Ubc13相互作用，延伸在組蛋白H2A上經(jīng)RNF8起始的泛素鏈，開啟下游效應(yīng)蛋白的募集，如腫瘤壞死因子BRCA1和53BP1。研究還發(fā)現(xiàn)，在DNA雙鏈損傷位點(diǎn)形成的Lys63連接的泛素鏈主要來(lái)源于RNF168的催化作用。雖然最近的一些相關(guān)研究指出了RNF8/RNF168依賴的泛素信號(hào)放大通路中存在的一些負(fù)調(diào)控因子，但是RNF168-Ubc13復(fù)合體調(diào)控

4、泛素信號(hào)放大的分子機(jī)制仍不明確，尤其是RNF8/RNF168與Ubc13之間相互識(shí)別的分子機(jī)理仍有待于進(jìn)一步研究。
　　為了詳細(xì)闡述RNF168的功能，我們解析了RNF168的RING結(jié)構(gòu)域(1-111氨基酸殘基)結(jié)構(gòu)。我們發(fā)現(xiàn)RNF168的RING結(jié)構(gòu)域核心區(qū)域的構(gòu)象與經(jīng)典的RING型鋅指結(jié)構(gòu)域的整體結(jié)構(gòu)相似，都由一個(gè)中心α螺旋，兩個(gè)反平行的β折疊以及兩個(gè)長(zhǎng)的loop組成，依靠與兩個(gè)鋅離子的配位來(lái)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。然而，我們通過(guò)將RNF

5、168的RING結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)與TRAF6-Ubc13、CHIP-Ubc13-MMS2、RNF8-Ubc13-MMS2的復(fù)合體結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)了在RNF168的RING結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)中存在一些構(gòu)象變化可能阻礙了與Ubc13的穩(wěn)定結(jié)合。此外，我們的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)也表明RNF168與Ubc13不能形成穩(wěn)定地相互作用，因此我們推測(cè)在DNA損傷信號(hào)通路中，RNF8和RNF168的RING結(jié)構(gòu)域作用機(jī)制并不一致。
　　PCNA(Proliferati

6、ng cell nuclear antigen)作為DNA聚合酶的輔因子，以三聚體的方式環(huán)繞DNA，它通過(guò)募集相關(guān)效應(yīng)蛋白到復(fù)制叉來(lái)協(xié)調(diào)眾多與基因復(fù)制相關(guān)的細(xì)胞過(guò)程，以此確?；蚪M的穩(wěn)定性。值得注意的是許多與PCNA結(jié)合的蛋白都與PCNA的同一個(gè)表面相互作用，它們具有一個(gè)稱為PIP-box的序列。泛素連接酶TRAIP也是一個(gè)RING型鋅指蛋白，我們發(fā)現(xiàn)在它的C末端具有一段PIP-box序列，因此它可能是PCNA的一個(gè)潛在配體。MTH2雖