環(huán)氧合酶-2介導(dǎo)鎘誘導(dǎo)腎損傷的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的:鎘及其化合物對哺乳動物的肝、腎、骨骼等臟器具有毒性損害作用。環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是花生四烯酸代謝形成前列腺素家族(prostaglandins，PGs)成員通路中的關(guān)鍵限速酶，其在調(diào)控細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡和血管形成中發(fā)揮重要作用。已有報道鎘經(jīng)由ROS誘導(dǎo)大鼠腎細(xì)胞中COX-2表達(dá)升高而引起腎損傷，同時也有報道自噬在鎘誘導(dǎo)的腎損傷中扮演重要的作用，但是COX-2和自噬在鎘暴露誘導(dǎo)腎毒性損傷中的

2、作用及其機(jī)制尚待闡明。本研究擬探討COX-2的表達(dá)是否參與鎘誘導(dǎo)的腎毒性損傷及其調(diào)控機(jī)制。
　　方法:(1)體內(nèi)試驗，采用8～10周雄性ICR小鼠，分為4組，包括對照組(0.9％生理鹽水)和CdCl2暴露組(0.2、1、5 mg/kg)，連續(xù)7天腹腔注射，采用HE染色觀察腎組織的損傷情況，qRT-PCR檢測腎組織中mMT1、mMT2、mPTGS2、mGRP78、mATF4、mCHOP、mIRE1α和mATF6的mRNA水平，免疫組

3、化檢測COX-2、GRP78和LC3的表達(dá)，Western Blot觀察COX-2、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，血清生化檢測腎功能指標(biāo)。(2)體外試驗:a）采用人胚腎HEK細(xì)胞給予不同劑量CdCl2(0～160μmol/L)分別處理12和24 h，采用MTT法檢測細(xì)胞活力。b）采用40μmol/L CdCl2建立損傷模型，qRT-PCR檢測細(xì)胞中hMT1B、hPTGS2、hGRP78、hATF4和hCHOP的mRNA水平

4、，Western Blot檢測COX-2、LC3、GRP78、ATF4、CHOP和p-eIF2α的蛋白水平，評價CdCl2對HEK細(xì)胞染毒導(dǎo)致的自噬和ER應(yīng)激結(jié)局效應(yīng)。c）采用激光共聚焦檢測COX-2、LC3、CHOP和ATF4蛋白的表達(dá)。d）采用PTGS2小干擾RNA(siRNA)或PTGS2敲低細(xì)胞株以及臨床干預(yù)藥物COX-2抑制劑塞來昔布，聯(lián)合CdCl2(40μmol/L)處理12h，驗證COX-2與自噬的調(diào)控關(guān)系。e）采用溶酶體

5、抑制劑氯喹(chloroquine，CQ)，或自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(rapamycin，rapa)聯(lián)合CdCl2(40μmol/L)處理12h，檢測自噬在此細(xì)胞模型中的作用。f）構(gòu)建HEK-Fluc-Gluc/-SEAP報告基因細(xì)胞檢測ER應(yīng)激的發(fā)生，采用ER應(yīng)激抑制劑或siRNA聯(lián)合CdCl2(40μmol/L)處理12h，驗證COX-2與ER應(yīng)激的調(diào)控關(guān)系。g）采用人腎近曲小管上皮HK-2細(xì)胞給予不同劑量CdCl2(0～160μmol

6、/L)分別處理12和24h，采用MTT法檢測細(xì)胞活力，qRT-PCR檢測細(xì)胞中hMT1B、hMT2A、hPTGS2、hGRP78和hATF4的mRNA水平，WesternBlot檢測COX-2、LC3、GRP78、ATF4和p-eIF2α的蛋白水平，進(jìn)行CdCl2對HK-2細(xì)胞染毒導(dǎo)致的自噬和ER應(yīng)激等結(jié)局效應(yīng)的驗證。
　　結(jié)果:(1)體內(nèi)試驗表明，與對照組相比，0.2和1 mg/kg CdCl2暴露組小鼠體重沒有顯著性差異，在5

7、 mg/kg高劑量組降低(P＜0.05);肝體比隨劑量的增加而增大，但腎體比沒有顯著性差異;CdCl2暴露組血清尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)的比值降低;HE染色結(jié)果顯示，CdCl2暴露組(1和5 mg/kg)出現(xiàn)腎小球萎縮和腎小管腫大、酸性顆粒增多，提示CdCl2可以誘導(dǎo)腎損傷和腎功能紊亂;CdCl2暴露組小鼠腎組織中COX-2、GRP78、ATF4、CHOP、p-eIF2α和LC3蛋白的表達(dá)都增加，且免疫組化結(jié)果證實COX-2、G

8、RP78、CHOP和LC3蛋白水平的增高。(2)體外試驗研究結(jié)果表明:a）CdCl2處理組HEK細(xì)胞活力抑制率呈濃度依賴性增高(12和24 h的IC50分別為69.7和51.6μmol/L);與對照組相比，CdCl2處理組細(xì)胞中hMT1B mRNA水平增高，hPTGS2 mRNA水平在3、6和12h均增高，且6h時最高，COX-2蛋白水平隨CdCl2濃度的增加而增高，代謝產(chǎn)物PGE2的產(chǎn)量也隨濃度的增加而升高。b）自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ

9、和p-AKT水平升高，p62（自噬底物蛋白）和p-mTOR的水平降低。c）CQ或rapa干預(yù)處理，CQ可部分挽救CdCl2誘導(dǎo)HEK細(xì)胞生長活力的抑制;rapa雖不能拯救細(xì)胞活力，但能使自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和p-AKT水平升高，p-mTOR的水平降低。d）COX-2抑制劑CAY10404、NS398或塞來昔布處理HEK細(xì)胞后可抵消CdCl2誘導(dǎo)的COX-2和LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)升高;而且，在siRNA或穩(wěn)定敲低PTGS2的細(xì)胞中表現(xiàn)的

10、類似結(jié)果對其進(jìn)行了驗證。e）相比對照組，CdCl2處理HEK細(xì)胞中hGRP78、hATF4、hCHOP的mRNA和蛋白水平均顯著增高(P＜0.05）;同時，HEK-Fluc-Gluc/SEAP細(xì)胞中報告基因結(jié)果顯示，CdCl2處理后Gluc和SEAP的蛋白分泌量減少。f) ER應(yīng)激抑制劑4-PBA或siRNA(siGRP78/siCHOP)干預(yù)處理細(xì)胞后也可抵消GRP78、ATF4、CHOP、p-eIF2α、COX-2和自噬標(biāo)志蛋白LC

11、3-Ⅱ的高表達(dá);而且，胞漿胞核蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，4-PBA和ATF4 siRNA可抑制ATF4的核轉(zhuǎn)位，且抑制胞漿中COX-2的表達(dá)。g）HK-2細(xì)胞給予不同濃度CdCl2(0～40μmol/L)處理后，與對照組相比，CdCl2處理組細(xì)胞中hMT1B和hMT2A的mRNA水平呈濃度-依賴性增高，hGRP78和hATF4的mRNA水平幾乎沒有改變，而hPTGS2 mRNA水平降低;WB結(jié)果顯示，GRP78、p-eIF2α、ATF4、LC3-Ⅱ