NGF通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)大鼠脊髓損傷修復(fù)的機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的:脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)是一種及其嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)性損傷，會(huì)引發(fā)一系列病理生理性反應(yīng)，包括缺血缺氧、脂質(zhì)過氧化、神經(jīng)元細(xì)胞凋亡等。目前很多實(shí)驗(yàn)研究顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，可以激活未折疊蛋白反應(yīng)等信號(hào)途徑，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及凋亡中起到非常重要的作用。盡管早期的未折疊蛋白反應(yīng)可以保護(hù)細(xì)胞免受錯(cuò)誤折疊蛋白的毒害，但是過度及持續(xù)的激活將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nerve growth fac

2、tor，NGF)作為一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子具有促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)及保護(hù)神經(jīng)元的作用。我們研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)NGF可以促進(jìn)大鼠脊髓損傷，進(jìn)一步研究NGF的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn):
　　(1) NGF可以抑制脊髓損傷引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的上調(diào)，減少急性損傷引起的神經(jīng)元凋亡，從而改善大鼠脊髓損傷，提高行為學(xué)能力。
　　(2) NGF抑制脊髓損傷引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是通過激活PI3K/Akt和ERK1/2這兩個(gè)信號(hào)通路介導(dǎo)的。
　　方法及結(jié)果:
　　(1

3、)采用擠壓型方法來制作SD大鼠急性脊髓損傷動(dòng)物模型，即用動(dòng)脈血管夾(30g，2min)壓迫脊髓T8～10段造成中度脊髓損傷模型。36只雌性SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組與NGF給藥組，按照不同時(shí)間點(diǎn)又分為1d，3d，7d，14d四組，采用BBB行為學(xué)評(píng)分、斜板實(shí)驗(yàn)及腳步印跡法對(duì)其后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。發(fā)現(xiàn)給予NGF組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的BBB評(píng)分、斜板角度及腳步印跡均優(yōu)于模型組，說明NGF能改善大鼠脊髓損傷后造成的行動(dòng)能力的下降。隨后于相應(yīng)

4、點(diǎn)處死大鼠，收集脊髓損傷節(jié)段作為組織標(biāo)本分別用于石蠟包埋切片HE染色、尼氏染色、免疫組織化學(xué)、免疫熒光、Western blot以及其他指標(biāo)的檢測(cè)。采用HE染色法觀察損傷脊髓細(xì)胞形態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NGF可以減少大鼠脊髓損傷造成的組織出血、核固縮等損傷。用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡同樣發(fā)現(xiàn)脊髓損傷組神經(jīng)元凋亡嚴(yán)重，而給予NGF組神經(jīng)元凋亡減少。用免疫組化法以及Western blot法來檢測(cè)脊髓組織中GRP78、CHOP/GADD153、C

5、aspase12的表達(dá)，結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了NGF對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的抑制作用。在體外實(shí)驗(yàn)中，我們用TG誘導(dǎo)PC12細(xì)胞模擬體內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，用免疫熒光法以及Western blot法檢測(cè)細(xì)胞蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)TG作用后細(xì)胞凋亡率上升，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白CHOP，GRP78，Caspase-12上調(diào)，而給予NGF組，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡率均下降。
　　(2)在發(fā)現(xiàn)NGF對(duì)脊髓損傷具有修復(fù)作用

6、，對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激具有抑制作用的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步探索NGF是如何抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而達(dá)到抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的作用的。我們結(jié)合一些文獻(xiàn)報(bào)道，PI3K/Akt和ERK1/2這兩個(gè)通路參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，結(jié)合本課題實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后PI3K/Akt和ERK1/2這兩個(gè)通路先被激活后被抑制。而在給予NGF的SCI的動(dòng)物脊髓組織標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt和ERK1/2這兩個(gè)通路始終處于激活狀態(tài)，從而達(dá)到持續(xù)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用。這一結(jié)果在體外PC12

7、細(xì)胞上得到了驗(yàn)證。因此，我們引入了LY294002(PI3K/Akt抑制劑)和PD98059(ERK1/2抑制劑)來進(jìn)一步證實(shí)NGF對(duì)PI3K/Akt和ERK1/2這兩個(gè)通路的上調(diào)作用。結(jié)果顯示當(dāng)分別阻斷這兩個(gè)通路時(shí)，NGF對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的抑制作用都被部分抑制了。流式結(jié)果也顯示，當(dāng)加入抑制劑后NGF對(duì)TG造成的PC12細(xì)胞凋亡保護(hù)作用降低。
　　結(jié)論:NGF通過激活PI3K/Akt和ERK1/2兩個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路來抑制內(nèi)