內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在糖尿病腎損害中的作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者中最常見(jiàn)且危害最大的合并癥之一。眾多的DN患者最終出現(xiàn)慢性腎功能不全,使得糖尿病成為目前全球終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)中最重要的原發(fā)病。DN的病理和病理生理發(fā)展是一個(gè)緩慢且復(fù)雜的過(guò)程,但是目前有眾多的實(shí)驗(yàn)研究證據(jù)支持過(guò)度的細(xì)胞凋亡是其中重要的發(fā)生機(jī)制。
　　 細(xì)胞凋亡是指在一定生理或病理?xiàng)l

2、件下機(jī)體為維護(hù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,通過(guò)有序的基因調(diào)控而誘導(dǎo)的細(xì)胞自殺。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增生共同調(diào)節(jié)各部分細(xì)胞總量的平衡。糖尿病狀態(tài)下,促使細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)因素大大增多,使得凋亡的強(qiáng)度大于細(xì)胞增生,導(dǎo)致組織細(xì)胞數(shù)量減少,器官功能減退。目前認(rèn)為有三條通路參與凋亡的發(fā)生:線(xiàn)粒體通路,死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路是新近研究發(fā)現(xiàn)的凋亡途徑,其核心內(nèi)容是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)反應(yīng)

3、。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細(xì)胞中具有重要的功能,主要是參與膜/分泌性蛋白、氨基多糖、磷脂、膽固醇及鈣信號(hào)等的代謝,特別是分泌性蛋白的合成與空間折疊、蛋白質(zhì)糖基化修飾、蛋白質(zhì)分泌等。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)外的因素打破了蛋白質(zhì)合成、成熟與降解之間的穩(wěn)態(tài),造成細(xì)胞內(nèi)異常蛋白堆集,將誘發(fā)ERS。ERS通過(guò)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)來(lái)適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)外的應(yīng)激,維持細(xì)胞的存活,主要的細(xì)胞反應(yīng)包括暫時(shí)性中斷細(xì)胞內(nèi)總體蛋白合成、上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

4、分子伴侶和折疊酶的表達(dá),誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解(ER-associated degradation,ERAD)處理蓄積的蛋白分子等,但是如果應(yīng)激因素持續(xù)存在或刺激過(guò)強(qiáng)時(shí),細(xì)胞功能不能恢復(fù)時(shí),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的細(xì)胞凋亡(ER-associated apoptosis)就會(huì)激活,受損細(xì)胞通過(guò)凋亡通路消亡,從而達(dá)到維護(hù)整體器官功能的目的。但是如果凋亡的范圍過(guò)大,速度過(guò)快,失去正常的調(diào)控,將導(dǎo)致組織細(xì)胞的大量喪失,同樣導(dǎo)致器官功能?chē)?yán)重減退。
　　

5、 腎臟細(xì)胞具有發(fā)達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。電鏡掃描顯示,腎小球的系膜細(xì)胞(mesangialcell)、腎小囊的足細(xì)胞(podocyte)和腎小管的上皮細(xì)胞(tubular epithelial cell)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)豐富而復(fù)雜。從細(xì)胞功能上講,腎臟細(xì)胞與蛋白的合成、分泌和降解關(guān)系密切:系膜細(xì)胞合成基膜和系膜基質(zhì)成分,吞噬和降解沉積在系膜上的免疫復(fù)合物,分泌腎素等生物活性物質(zhì)；足細(xì)胞是腎臟濾過(guò)屏障的組成部分,細(xì)胞膜外聯(lián)結(jié)有豐富的糖蛋白,其完整性直接

6、影響腎小球的濾過(guò)功能；腎小管上皮細(xì)胞除了重吸收管腔內(nèi)的蛋白質(zhì)并將其代謝掉,還可分泌激肽釋放酶等活性分子。腎臟細(xì)胞的這些諸多功能很大程度上依賴(lài)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來(lái)完成。因此,從細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能分析,腎臟具有發(fā)生ERS的條件和基礎(chǔ)。
　　 從ERS激活的刺激因素來(lái)講,糖尿病狀態(tài)下可能的刺激因素大大增加,包括高血糖,氧化應(yīng)激,蛋白尿以及細(xì)胞內(nèi)外電解質(zhì)紊亂等,但目前關(guān)于ERS與糖尿病腎損害的具體試驗(yàn)證據(jù)尚不充分。因此,闡明糖尿病腎臟損害中ERS相

7、關(guān)細(xì)胞凋亡的概況,明確觸發(fā)凋亡的應(yīng)激因素,了解凋亡通路的過(guò)程,從而對(duì)細(xì)胞凋亡做到適當(dāng)?shù)母深A(yù)調(diào)節(jié),挽救殘存的腎臟細(xì)胞,對(duì)保護(hù)糖尿病患者的腎臟功能具有重要的積極意義。
　　 研究目的：
　　 1.構(gòu)建糖尿病大鼠模型,驗(yàn)證糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞凋亡增加；
　　 2.明確內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞中是否激活；
　　 3.明確內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡通路在糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞凋亡中的信號(hào)通路。
　　 研究方法：

8、r>　　 1.糖尿病大鼠模型的構(gòu)建
　　 7周左右的雄性Wistar大鼠30只,體重280±10g。隨機(jī)分為2組:對(duì)照組10只,糖尿病組20只。標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,禁食12h,糖尿病組大鼠腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素(STZ)65mg/kg(溶于pH4.5的檸檬酸鹽緩沖液),對(duì)照組大鼠則注射等量同pH值的檸檬酸鹽緩沖液。糖尿病大鼠成模的診斷標(biāo)準(zhǔn)為:STZ注射7天后,尾靜脈取血測(cè)定空腹血糖≥16.7mmol/L(300mg/d

9、l)。未達(dá)此標(biāo)準(zhǔn)者則剔除。糖尿病組大鼠自血糖達(dá)到成模標(biāo)準(zhǔn)后,繼續(xù)喂養(yǎng)16周,處死取材。
　　 2.血糖監(jiān)測(cè)和24小時(shí)尿白蛋白的測(cè)定
　　 血糖每4周檢測(cè)一次,造模后第1周和第16周利用代謝籠收集大鼠24小時(shí)尿液,測(cè)定尿白蛋白含量。
　　 3.腎臟組織病理學(xué)檢查
　　 第16周末動(dòng)物處死后,進(jìn)行腎臟組織取材、固定、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片,常規(guī)蘇木素-伊紅染色(H&E)和過(guò)碘酸雪夫染色(PAS),判

10、斷糖尿病大鼠是否出現(xiàn)DN的病理表現(xiàn)。
　　 4.TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　 利用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)試劑盒,進(jìn)行石蠟切片的TUNEL染色,觀察并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡水平。
　　 5.免疫組織化學(xué)檢測(cè)
　　 取石蠟組織切片,進(jìn)行GRP78,Caspase-12,p-JNK和CHOP免疫組織化學(xué)染色,觀察各個(gè)指標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞的分布和強(qiáng)度。
　　 6.免疫印跡Wes

11、tern blot檢測(cè)
　　 取-80℃保存腎臟組織,提取總蛋白,經(jīng)過(guò)10％--14％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育、ECL顯色等步驟,檢測(cè)GRP78、Caspase-12、CHOP、Total-JNK和p-JNK的蛋白表達(dá)水平。
　　 7.實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)
　　 利用Trizol法提取兩組腎臟組織RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到總cDNA,以β-actin作為參照,通過(guò)re

12、al-time PCR技術(shù)檢測(cè)GRP78、Caspase-12、CHOP和JNK的mRNA表達(dá)水平。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基本情況
　　 對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好,體重增加明顯,反應(yīng)敏捷,毛色白而光澤。糖尿病組大鼠精神萎靡,體重增加遲緩,出現(xiàn)多食、多飲、多尿和消瘦等癥狀,皮毛臟亂無(wú)光澤,部分出現(xiàn)爛尾、白內(nèi)障等。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中3只大鼠死亡,均為糖尿病組,死亡因?yàn)榭赡芘c糖尿病酮癥酸中毒、感染或其他相關(guān)

13、并發(fā)癥有關(guān)。最終共27只完成實(shí)驗(yàn),其中對(duì)照組10只,糖尿病組17只。
　　 2.大鼠DN的確定
　　 實(shí)驗(yàn)組大鼠DN的確定通過(guò)血糖和24小時(shí)尿白蛋白的測(cè)定以及腎臟組織切片病理檢查共同確定。糖尿病大鼠組血糖自成模后第一次測(cè)量后,一直維持在16.7mmol/L以上,與對(duì)照組相比,具有顯著性差異(P<0.05)。16周末24小時(shí)尿蛋白測(cè)定,與對(duì)照組相比,糖尿病組大鼠明顯升高(P<0.05)。病理切片檢查示與對(duì)照組大鼠腎臟比較,

14、糖尿病大鼠腎小球體積增大,系膜基質(zhì)增多,腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性,小灶樣萎縮,小動(dòng)脈管壁增厚,腎間質(zhì)纖維化和玻璃樣變。因此可判斷糖尿病大鼠組出現(xiàn)DN改變。
　　 3.糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞凋亡增加
　　 TUNEL,染色檢測(cè)腎臟細(xì)胞凋亡水平,結(jié)果示與對(duì)照組大鼠相比較,糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.05),凋亡細(xì)胞在腎小球和腎小管中均可觀察到。
　　 4.糖尿病腎臟中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78表達(dá)上調(diào)

15、　　 GRP78是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中重要的分子伴侶,幫助蛋白質(zhì)的折疊和成熟,是廣泛使用的ERS激活的標(biāo)志分子。免疫組織化學(xué)、免疫印跡法和實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)GRP78在兩組腎臟組織中的分布范圍和表達(dá)水平。結(jié)果顯示,正常腎臟組織中,GRP78在腎小管細(xì)段和遠(yuǎn)曲腎小管上皮細(xì)胞中有輕度表達(dá),而在糖尿病腎臟中,GRP78在腎小球和近端腎小管表達(dá)升高,在腎小管細(xì)段以及遠(yuǎn)端腎小管的表達(dá)則有顯著的升高(P'<0.05)。蛋白水平和mRNA水平的檢測(cè)結(jié)果與

16、免疫組化結(jié)果相一致,GRP78在糖尿病腎臟中表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。ERS在糖尿病腎損害中激活。
　　 5.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡通路的檢測(cè)
　　 CHOP,JNK和Caspase-12分別是三條內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡通路中的關(guān)鍵分子。三條通路相對(duì)獨(dú)立,任一通路的激活均可導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。Western blot檢測(cè)結(jié)果示與對(duì)照組相比,糖尿病組CHOP,p-JNK和Caspase-12的表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)。mRNA水

17、平檢測(cè),糖尿病組JNK mRNA水平與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05),CHOP,Caspase-12 mRNA表達(dá)水平則明顯升高(P<0.05)。免疫組化結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,在糖尿病大鼠腎臟中,三個(gè)分子的分布范圍和表達(dá)強(qiáng)度明顯升高,但三個(gè)分子之間相比,分布范圍存在顯著差異。Caspase-12在對(duì)照組腎臟組織中不能檢測(cè)到,在糖尿病腎臟中,陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在腎小球中；p-JNK的分布主要是腎小球和腎小管區(qū)間質(zhì)中,尤其是間質(zhì)的小

18、血管中,呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；CHOP的分布則主要是遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞中,在腎小球和近端小管中也可檢測(cè)到顆粒樣陽(yáng)性表達(dá)。因此,3條內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡通路都可能參與DN的病理發(fā)生,但具體的激活途徑和應(yīng)激細(xì)胞存在差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠16周,出現(xiàn)DN的表現(xiàn),腎臟細(xì)胞凋亡增加；
　　 2.糖尿病大鼠腎臟GRP78的表達(dá)顯著上調(diào),ERS在糖尿病大鼠腎損害中激活；
　　 3.CHOP,JNK和Ca