內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在糖尿病誘發(fā)血管損傷過程中的作用機(jī)制研究.pdf

1、背景：流行病學(xué)研究表明，糖尿病患者的心血管并發(fā)癥成為其最常見的致死和致殘?jiān)?。糖尿病（Diabetes mellitus，DM）能夠引起血管功能紊亂，并最終發(fā)展為高血壓，但其具體的作用機(jī)制尚不明確。有研究報(bào)道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS)廣泛存在于糖尿病患者體內(nèi)的多種組織和器官，并與代謝性疾病密切相關(guān)。近期發(fā)現(xiàn)ERS在心血管疾病，包括糖尿病心血管并發(fā)癥、動脈粥樣硬化及心力衰竭的發(fā)病過程中發(fā)

2、揮重要作用。那么，ERS是否是連接高血糖和糖尿性血管功能紊亂的樞紐成為本研究關(guān)注的重點(diǎn)。本課題以高血糖動物的小血管為研究對象，旨在對高血糖誘發(fā)血管損傷的分子機(jī)制進(jìn)行探討，并觀察微血管內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在糖尿病誘發(fā)血管損傷過程所發(fā)揮的作用。
　　方法：本研究建造兩種大鼠模型：1）領(lǐng)取12周齡SD雄性大鼠，隨機(jī)分為2組：①按照35 mg/kg劑量腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozocin， STZ）誘導(dǎo)高血糖模型，選擇血糖水平持續(xù)高于16.

3、7 mM且低于26.0 mM的動物作為糖尿病組（STZ）；②腹腔注射等體積溶媒（檸檬酸鹽緩沖液）作為對照組（Control, Con）。成模后1個月以無創(chuàng)尾動脈血壓測定法檢測血壓，期間監(jiān)測大鼠體質(zhì)量和隨機(jī)血糖。血壓檢測完畢后處死，取大鼠腸系膜阻力血管（mesenteric resistant arteries，MRA），采用蛋白印跡法（Western blotting）測定胰島素信號通路關(guān)鍵因子蛋白激酶B(protein kinase

4、B, Akt/PKB)及胰島素受體底物1(insulin receptor substrate1, IRS1)及內(nèi)皮型一氧化氮合酶（ endothelial nitric oxide synthase, eNOS)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平；實(shí)時熒光定量PCR（RT-PCR）測定大鼠 MRA中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78, GRP78)、RNA依賴的蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（RNA-d

5、ependent protein kinase R-like ER kinase, PERK）、真核翻譯起始因子2α（eukaryotic initiation factor2α, eif2α)、X盒結(jié)合蛋白1（X-box binding proteinⅠ, Xbp-1)、轉(zhuǎn)錄激活因子6（activating transcription factor6, ATF6)、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-bi

6、nding protein homologous protein, CHOP）的基因轉(zhuǎn)錄水平；及ERS標(biāo)志物葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein, GRP78)的蛋白表達(dá)水平。2）高血糖雄性大鼠與正常雌鼠交配，其子鼠為實(shí)驗(yàn)組（offspring of diabetes mellitus, DM-O）,正常雄性大鼠與正常雌鼠交配，其子鼠為對照組（offspring of Control, Con-O）。兩

7、組子鼠出生后監(jiān)測體重、隨機(jī)血糖和空腹血糖；實(shí)施葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)；檢測血壓。給予內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸（4-Phenylbutyrate acid,4-PBA）灌胃處理1個月后處死動物，收集MRA和肝臟組織。Western blotting測定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)水平；IRS1、Akt及eNOS的蛋白質(zhì)表達(dá)水平及其磷酸化水平。肝臟組織進(jìn)行透射電子顯微鏡觀測。
　　結(jié)果：1）與對照組相比，糖尿病大鼠血糖水平顯著升高，體質(zhì)量明顯

8、下降，收縮壓、舒張壓及平均動脈壓均明顯升高。Western blotting結(jié)果表明胰島素信號通路關(guān)鍵因子 IRS1、Akt的磷酸化水平均顯著下降；影響血管舒縮功能的eNOS磷酸化水平顯著低于對照組，總eNOS蛋白表達(dá)水平不變；ERS標(biāo)志物GRP78/Bip蛋白表達(dá)水平顯著升高。RT-PCR結(jié)果顯示糖尿病大鼠MRA中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子的基因表達(dá)水平顯著升高。2）糖尿病組子代體重明顯增加，葡萄糖耐量受損。透射電鏡觀察到糖尿病組子代肝臟細(xì)胞