內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在小鼠狼瘡腎炎中的發(fā)病機(jī)制研究.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種復(fù)雜的自體免疫性疾病，幾乎影響身體各個器官，其中沉積在腎臟的自身抗體及免疫復(fù)合物(immune complexes，IC)能觸發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致狼瘡腎炎(lupusnephritis，LN)，可發(fā)展至終末期腎病[1]。LN的發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前LN的治療主要依靠激素和免疫抑制劑。長期使用激素可引起諸如高血壓、血糖升高、誘發(fā)感染、骨質(zhì)疏松等不良反應(yīng)。而

2、使用免疫抑制劑可出現(xiàn)骨髓抑制、肝腎損害等副作用。因此，探討狼瘡腎炎的發(fā)病機(jī)制有助于探尋療效確切、副作用小的治療手段。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是否參與到LN的發(fā)病機(jī)制尚未明確，本研究通過觀察MRL/lpr小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激現(xiàn)象、利用4-苯基丁酸（4-phenyl butyric acid,4-PBA）抑制ERS，觀察其變化，探討LN的發(fā)病機(jī)制，有助于為LN的治療提供新思路。

3、r>　　一、材料和方法：
　　1.小鼠狼瘡腎炎模型及干預(yù)方案
　　選用12周齡的雌性MRL/lpr小鼠共16只，隨機(jī)分為4-PBA干預(yù)組和溶媒對照組，每組8只。同時選取8只12周齡雌性健康小鼠作為正常對照組。4-PBA干預(yù)組小鼠給予1.0 g.kg-1.d-1劑量的4-PBA灌胃。正常對照組和溶媒對照組則分別給予等體積生理鹽水灌胃。治療前及治療過程中第4、8和12周檢測24小時尿蛋白定量;第12周檢測血肌酐(SCr)和尿素氮

4、(BUN)。
　　2.組織學(xué)損傷評估
　　腎組織石蠟切片行HE、PAS染色，觀察腎小球、腎小管及腎血管病理損害情況。
　　3.免疫組織化學(xué)染色及量化
　　腎組織石蠟切片行免疫組化染色觀察腎小球、腎間質(zhì)及腎血管周圍CD3+T細(xì)胞浸潤情況。
　　4.RT-PCR檢測mRNA表達(dá)
　　提取腎臟組織總RNA，以GAPDH作為內(nèi)參照，檢測GRP78、CHOP、PERK、eIF2α、ATF4、IRE1α、XBP1

5、、ATF6mRNA表達(dá)，計算目標(biāo)條帶與內(nèi)參照條帶密度的比值。
　　5.Western blot檢測蛋白表達(dá)
　　提取腎臟組織總蛋白，以GAPDH作為內(nèi)參照，檢測GRP78、CHOP、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、p-IRE1α、XBP1、ATF6蛋白表達(dá)。提取腎臟組織的核蛋白，以Fibrillarin作為內(nèi)參照，檢測核內(nèi)NF-κB p65表達(dá)，計算目標(biāo)條帶與內(nèi)參照條帶密度的比值。
　　6.ELISA
　

6、　提取腎臟組織勻漿的上清液，利用ELISA檢測上清液MCP-1、TNF-α、IL-6水平。
　　7.統(tǒng)計學(xué)分析
　　組間均數(shù)的比較使用方差分析(ANOVA)，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05證明存在統(tǒng)計學(xué)差異。
　　二、結(jié)果：
　　1.MRL/lpr小鼠LN中的ERS現(xiàn)象
　　與正常小鼠相比，MRL/lpr小鼠腎臟中ERS相關(guān)標(biāo)志物GRP78 mRNA及GRP78蛋白的表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，

7、且ERS信號通路PERK和IRE1α的磷酸化蛋白表達(dá)也明顯升高(P＜0.05)。
　　2.MRL/lpr小鼠蛋白尿變化情況
　　MRL/lpr小鼠在12周齡開始出現(xiàn)蛋白尿，與正常對照組小鼠比較，溶媒對照組小鼠的24小時尿蛋白定量明顯增多(P＜0.05);在4-PBA干預(yù)12周后，4-PBA干預(yù)組小鼠的24小時尿蛋白排泄量顯著低于溶媒對照組(P＜0.05)。
　　3.MRL/lpr小鼠血生化變化情況
　　與正常對照

8、組比較，溶媒對照組小鼠的血BUN和SCr均顯著升高(P＜0.05);4-PBA干預(yù)12周后，4-PBA干預(yù)組小鼠的血BUN及SCr顯著低于溶媒對照組(P＜0.05)。
　　4.MRL/lpr小鼠腎臟組織學(xué)變化情況
　　與正常對照組比較，溶媒對照組小鼠腎小球、腎小管間質(zhì)及腎血管評分均明顯增加(P＜0.05);4-PBA干預(yù)12周后，4-PBA干預(yù)組小鼠的腎臟組織評分顯著低于溶媒對照組(P＜0.05)。
　　5.MRL/l

9、pr小鼠腎臟炎癥細(xì)胞浸潤情況
　　與正常對照組比較，溶媒對照組小鼠的腎組織CD3+T淋巴細(xì)胞浸潤明顯增多(P＜0.05);4-PBA干預(yù)12周后，4-PBA干預(yù)組CD3+T淋巴細(xì)胞浸潤程度較溶媒對照組顯著減輕(P＜0.05)。
　　6.MRL/lpr小鼠腎臟GRP78、CHOP、PERK、eIF2α、ATF4、IRE1α、XBP1、ATF6 mRNA表達(dá)情況
　　RT-PCR結(jié)果顯示，與正常對照組比較，溶媒對照組小鼠的

10、GRP78、CHOP、PERK、eIF2α、ATF4、IRE1α、XBP1、ATF6 mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.05);4-PBA干預(yù)12周后，4-PBA干預(yù)組以上指標(biāo)較溶媒對照組顯著降低(P＜0.05)。
　　7.MRL/lpr小鼠腎臟GRP78、CHOP、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、p-IRE1α、 XBP1、ATF6蛋白表達(dá)情況
　　Western blot結(jié)果顯示，與正常對照組比較，溶媒對照組小

11、鼠的GRP78、CHOP、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、p-IRE1α、XBP1、ATF6蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.05);4-PBA干預(yù)12周后，4-PBA干預(yù)組以上指標(biāo)較溶媒對照組顯著降低(P＜0.05)。
　　8.MRL/lpr小鼠腎臟MCP-1、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)情況
　　ELISA結(jié)果顯示，與正常對照組比較，溶媒對照組小鼠的腎組織勻漿MCP-1、TNF-α、IL-6含量均顯著升高(P＜0.

12、05);4-PBA干預(yù)12周后，4-PBA干預(yù)組以上指標(biāo)較溶媒對照組顯著降低(P＜0.05)。
　　9.MRL/lpr小鼠腎臟NF-κB活化情況
　　Western blot結(jié)果顯示，與正常對照組比較，溶媒對照組小鼠腎臟核蛋白表達(dá)量均顯著升高(P＜0.05);4-PBA干預(yù)12周后，4-PBA干預(yù)組腎臟核蛋白表達(dá)量較溶媒對照組顯著降低(P＜0.05)。
　　三、小結(jié)：
　　本研究發(fā)現(xiàn)在MRL/lpr小鼠中存在ER

13、S，使用ERS抑制劑4-PBA進(jìn)行干預(yù):
　　1.減少MRL/lpr小鼠尿蛋白的排泄，改善腎功能;
　　2.減輕腎臟病理損害;
　　3.抑制腎臟炎癥細(xì)胞浸潤;
　　4.抑制腎臟NF-κB活化;
　　5.減少促炎癥細(xì)胞因子MCP-1、TNF-α、IL-6的表達(dá);
　　6.抑制ERS狀態(tài)。
　　結(jié)論：
　　本研究發(fā)現(xiàn)在小鼠LN中:
　　1.ERS參與小鼠LN的發(fā)病;
　　2.ERS