TLR-2介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路在光滑念珠菌感染大鼠氣道上皮細(xì)胞中的作用研究.pdf

1、第一部分：光滑念珠菌感染大鼠氣道上皮細(xì)胞的研究
　　目的：通過建立光滑念珠菌感染大鼠氣道上皮細(xì)胞（Rat tracheal epithelia cell，RTEC）的體外模型，觀察光滑念珠菌感染RTEC在不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖、周期及凋亡的變化，分別在蛋白和細(xì)胞水平檢測 TLR-2、NF-κB（p65）、TNF-α和IL-6表達(dá)情況，以探討TLR-2受體介導(dǎo)的NF-κB（p65）信號(hào)通路在光滑念珠菌感染RTEC的研究。方法：RTEC感

2、染光滑念珠菌，感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of infection, MOI)為1。在0h、2h、4h及6h終止感染，分別采用CCK-8（cell counting kit8，CCK-8）檢測細(xì)胞存活率。流式細(xì)胞儀檢測在不同感染時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞周期和凋亡變化情況。Western Blot（WB）方法檢測細(xì)胞膜表面TLR-2受體及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（p65）在不同感染時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化。ELISA方法檢測下游細(xì)胞因子TNF-α和IL-6

3、在不同感染時(shí)間點(diǎn)的分泌情況。結(jié)果：CCK-8法檢測結(jié)果表明，隨著時(shí)間的延長，光滑念珠菌感染對(duì)RTEC的增殖有明顯的抑制作用。流式細(xì)胞儀檢測周期結(jié)果顯示，光滑念珠菌感染細(xì)胞能夠使細(xì)胞的生長周期阻滯在 G0/G1期，抑制細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。采用 Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，隨著感染時(shí)間的延長，細(xì)胞凋亡的比例顯著增加。Western Blot結(jié)果表明，隨著感染時(shí)間的延長TLR-2受體與N

4、F-κB（p65）蛋白表達(dá)水平顯著增加。ELISA結(jié)果表明， TNF-α和IL-6分泌水平也隨著感染時(shí)間的延長而顯著升高。結(jié)論：光滑念珠菌感染RTEC能抑制細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞存活率。在靜息狀態(tài)下TLR-2受體表達(dá)水平較低，在光滑念珠菌感染的過程中能啟動(dòng) TLR-2受體的表達(dá)，并激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（p65），誘導(dǎo)下游細(xì)胞因子和炎癥因子TNF-α和IL-6的分泌及表達(dá)。這一現(xiàn)象可能在RTEC應(yīng)對(duì)光滑念珠菌感染的免疫防御調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重

5、要的作用。
　　第二部分：siRNA干擾TLR-2受體對(duì)大鼠氣道上皮細(xì)胞的影響
　　目的：siRNA干擾 TLR-2受體對(duì)光滑念珠菌感染大鼠氣道上皮細(xì)胞（RTEC）的影響。方法：通過轉(zhuǎn)染siRNA抑制RTEC TLR-2受體（Toll-like receptor2，TLR-2）的表達(dá)，構(gòu)建感染模型，采用與第一部分相同的檢測方法，進(jìn)一步觀察轉(zhuǎn)染后感染光滑念珠菌的RTEC增殖、周期和凋亡變化情況，以及TLR-2受體、核轉(zhuǎn)錄因子N

6、F-κB（p65）、下游細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá)變化。結(jié)果：轉(zhuǎn)染TLR-2 siRNA的 RTEC感染光滑念珠菌后進(jìn)一步抑制細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞儀檢測周期結(jié)果表明，細(xì)胞在 G0/G1生長期的比例增高，細(xì)胞生長周期阻滯在 G0/G1期，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。采用Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測凋亡結(jié)果顯示，隨著感染時(shí)間的延長，細(xì)胞凋亡的比例顯著增加。Western Blot及ELISA結(jié)果均表明，轉(zhuǎn)染后TL

7、R-2、NF-κB（p65）、TNF-α和IL-6的表達(dá)水平顯著降低。結(jié)論：TLR-2受體可以啟動(dòng)光滑念珠菌感染RTEC的免疫反應(yīng)，并引起炎癥反應(yīng)，表明是由于TLR-2受體介導(dǎo)的細(xì)胞損傷。RTEC啟動(dòng)TLR-2受體的表達(dá)是建立在 TLR-2受體對(duì)光滑念珠菌早期識(shí)別的基礎(chǔ)上，并通過 TLR-2--NF-κB下游信號(hào)通路啟動(dòng)TLR-2受體的表達(dá)。
　　第三部分：NF-KB抑制劑PDTC抑制NF-KB的活性對(duì)大鼠氣道上皮細(xì)胞的影響

8、>　　目的：探討 NF-KB抑制劑（PDTC）對(duì)光滑念珠菌感染大鼠氣道上皮細(xì)胞（RTEC）的影響。方法：加入PDTC預(yù)處理RTEC2h后，建立體外感染模型，采用與第一及第二部分相同的檢測方法，進(jìn)一步觀察加入PDTC后，感染光滑念珠菌的RTEC增殖、周期和凋亡的變化情況，以及TLR-2受體、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（p65）、下游細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá)變化。結(jié)果：加入PDTC預(yù)處理的RTEC與轉(zhuǎn)染siRNA抑制RTEC TLR-2

9、受體的結(jié)果類似，感染光滑念珠菌后均抑制細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞儀檢測周期結(jié)果表明，細(xì)胞在G0/G1生長期的比例增高，細(xì)胞生長周期阻滯在 G0/G1期，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。采用Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測凋亡結(jié)果顯示，隨著感染時(shí)間的延長，細(xì)胞凋亡的比例顯著增加。預(yù)處理后的 TLR-2受體、核轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB（p65）在前4h表達(dá)受到抑制，雖然 NF-κB（p65）在第6h有所升高但也只是達(dá)到基線水平，TNF-α和IL-