白細胞介素-1受體相關激酶-2在TLR介導的信號通路中的功能研究.pdf

1、目的:
　　白細胞介素-1受體相關激酶-2(IRAK2)是Toll樣受體(TLR)介導的信號通路中重要的蛋白激酶和調(diào)節(jié)分子,但其功能和作用機理還不完全清楚。本研究利用IRAK2基因敲除小鼠和同背景野生型小鼠,探討IRAK2在TLR4和TLR9介導的信號通路中的功能及對前炎癥細胞因子的調(diào)節(jié)機制。首先闡明IRAK2對內(nèi)毒素所致膿毒性休克的作用,進而將小鼠骨髓干細胞分化為巨噬細胞(BMMs),研究IRAK2在TLR4介導的信號通路中的功

2、能及其對前炎癥細胞因子的調(diào)節(jié)機制;鑒定IRAK2的激酶活性并研究其在TLR4介導的信號通路中的功能和調(diào)節(jié)前炎癥細胞因子的機制。在TLR9介導的信號通路中,利用胞漿樣樹突狀細胞,研究IRAK2在DNA病毒感染和CpG誘導的前炎癥細胞因子及干擾素中的作用;并利用BMMs,研究IRAK2對TLR9介導基因表達普及NF-κB活化的影響,進一步闡明IRAK2在TLR9介導的信號通路中的功能。由于IRAK2在TLRs介導的炎癥反應和機體自身修復中發(fā)

3、揮關鍵作用,對IRAK2調(diào)節(jié)炎癥反應機制的闡明,有望為炎癥治療開辟新的途徑;同時,作為重要的蛋白激酶,IRAK2本身亦可能成為一個很有潛力的治療靶點。
　　方法:
　　將LPS按20mg/kg注射到野生型和同背景IRAK2基因敲除小鼠腹腔,比較野生型和IRAK2基因缺失小鼠對LPS引起的膿毒性休克而導致死亡率的差別,并檢測注射LPS的小鼠(4mg/kg)血清中前炎癥細胞因子IL1β、IL6、TNFα的濃度,以評價 IRAK2

4、在內(nèi)毒素所致膿毒性休克中的作用;將小鼠骨髓干細胞在體外分化為巨噬細胞(BMMs),采用 ELISA技術檢測 LPS和R848誘導的BMMs培養(yǎng)上清中Il6、KC和TNFα的濃度,初步確定IRAK2在TLR4和TLT7介導的信號通路中的功能;進一步采用Realtime PCR,檢測IRAK2在TLR4介導的前炎癥細胞因子mRNA穩(wěn)定性中發(fā)揮的作用;并用多聚核糖體分離技術將LPS誘導表達的mRNA分為具有翻譯活性和沒有翻譯活性的兩相,結(jié)合R

5、ealtime PCR分別檢測兩相中mRNA的量,以評估IRAK2對TLR4介導的前炎癥細胞因子mRNA翻譯水平的調(diào)節(jié)作用;然后構(gòu)建野生型 IRAK2(IRAK2-WT)及IRAK2的ATP結(jié)合位點突變體(IRAK2-KD)的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達系統(tǒng),包裝病毒后感染IRAK2基因敲除的BMMs,使外源IRAK2高表達以重建其功能,并采用該細胞模型來鑒定 IRAK2的激酶活性和研究其激酶活性與下游底物活化之間的關系,探討IRAK2激酶活性在TL

6、R4信號通路中對前炎性因子的調(diào)節(jié)作用。
　　利用鼠皰疹病毒68(MHV68)感染或者用CpG A刺激小鼠胞漿細胞樣樹突狀細胞(pDC),檢測細胞培養(yǎng)上清中I型干擾素(IFNα和IFNβ)、TNFα和KC的濃度,初步了解在DNA病毒感染或TLR9信號通路中,IRAK2對干擾素和前炎癥細胞因子的調(diào)節(jié)功能;然后在CpG A刺激pDC的多個時間點(包括早期和晚期)檢測IFNα和IFNβ的mRNA表達,并制備CpG A刺激pDC的核提取物,

7、western blot檢測 CpG A刺激下 IRF7的核轉(zhuǎn)位,作為激活 I型干擾素表達的指標;用western blot檢測IκBα、P38、ERK和JNK的磷酸化,以觀察IRAK2在TLR9信號通路中對NF-κB和MAP激酶信號激活的作用;進一步在BMMs中,研究IRAK2對TLR9介導的NF-κB和MAP激酶信號激活、對TNFα表達和分泌的影響,比較野生型和IRAK2缺失BMMs中基因表達普的差別,以及IRAK2與其他信號分子之

8、間的相互作用,探討IRAK2對TLR9介導的前炎癥細胞因子的調(diào)節(jié)機制。
　　結(jié)果:
　　IRAK2基因缺失小鼠在腹腔注射20mg/ml的LPS后7天仍有80％以上存活,而相應的野生型小鼠則不到20%存活,顯示IRAK2基因缺失小鼠對LPS誘導的膿膿毒性休克耐受,且IRAK2基因缺失小鼠血清中的前炎癥細胞因子IL1β、IL6、TNFα的濃度比野生型小鼠低;BMMs在LPS和R848刺激下,IRAK2缺失的細胞產(chǎn)生的細胞因子(I

9、L6、TNFα)和趨化因子(KC,即 CXCL1)比野生型細胞明顯減少;BMMs在LPS誘導1.5h后,野生型和IRAK2缺失細胞表達的mRNA水平接近,但在放線菌素D處理阻斷基因轉(zhuǎn)錄后,IL6和KC的mRNA在IRAK2缺失的BMMs中降解的速度比野生型細胞快;在翻譯水平上,在IRAK2缺失的BMMs中檢測到具有翻譯活性的mRNA所占總 mRNA的百分比低于野生型細胞,同時,在IRAK2缺失的BMMs中,有翻譯活性mRNA跟無翻譯活性

10、mRNA的比率亦低于野生型細胞;LPS誘導的MKK3/6、MnK1和eIF4E的磷酸化及TTP的修飾與穩(wěn)定性在IRAK2缺失的BMMs亦下調(diào),這可能是導致mRNA的穩(wěn)定性和翻譯活性下降,從而導致前炎癥因子的產(chǎn)生減少的原因。體外激酶試驗顯示IRAK2具有激酶活性,并且依賴LPS的刺激而增強;用逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)將外源IRAK2導入IRAK2基因缺失BMMs后,細胞恢復了對TLR配體刺激產(chǎn)生前炎癥細胞因子的功能,但表達IRAK2-WT比表達IR

11、AK2-KD的BMMs產(chǎn)生的IL6、KC和TNFα多;在mRNA穩(wěn)定性和翻譯水平上,表達IRAK2-KD的BMMs比表達IRAK2-WT的BMMs均有明顯的降低。
　　MHV68感染IRAK2缺失pDCs比野生型細胞產(chǎn)生更多干擾素,且TLR9介導IRF7的核轉(zhuǎn)位和干擾素產(chǎn)生及IκBα、P38、ERK和JNK的磷酸化也在IRAK2缺失的pDCs增加,但前炎癥細胞因子TNFα和KC在IRAK2缺失的pDCs的分泌比野生型細胞少;基因表

12、達譜分析顯示:在TLR9的配體CpG B誘導2h后,IRAK2缺失的巨噬細胞和野生型細胞相比,大部分基因表達增高,而TLR7的配體R848誘導的基因表達在IRAK2缺失的巨噬細胞中則減少;定量PCR的結(jié)果顯示:雖然IRAK2缺失的巨噬細胞在CpG刺激的早期(0.5、1和2h)KC和TNFα的mRNA表達比野生型細胞多,但在后期(4h)卻由于降解更快而比野生型細胞少,所以IRAK2缺失的巨噬細胞產(chǎn)生的TNFα、KC和IL6比野生型巨噬細胞

13、少;此外,野生型BMMs表達TNFα的百分率比IRAK2缺失的細胞高,但分泌的TNFα卻比IRAK2缺失的細胞少;BMMs在R848刺激下,IRAK2與MyD88和TRAF6均發(fā)生相互作用,但在CpG B作用下,IRAK2與TRAF6只有極微弱的結(jié)合,而與MyD88則沒有相互作用,且沒有觀察到IRAK2自身的修飾。
　　結(jié)論:
　　IRAK2缺失導致TLR4、TLR7和TLR9介導的前炎癥細胞因子產(chǎn)生減少;IRAK2及其蛋白