鴨白細(xì)胞介素2配體與受體alpha的研究.pdf

1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文鴨白細(xì)胞介素2配體與受體alpha的研究姓名：王金勇申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：周繼勇20060401浙江大學(xué)搏士學(xué)位論文摘要王金勇2006復(fù)性單體能刺激T淋巴細(xì)胞增殖，且呈劑量依賴(lài)性；高劑量連續(xù)注射rdulL一2引起鴨發(fā)熱、多臟器炎癥等毒副作用；雞靜脈注射低rdulL2(O125鷴)后其CD4T細(xì)胞上調(diào)，且上調(diào)水平與注射劑量沒(méi)有直接相關(guān)性，而CD8T細(xì)胞含量變化不明顯，低劑量的鴨1L2能夠明顯提高重組

2、禽流感滅活疫苗HI效價(jià)。而劑量過(guò)高則會(huì)抑制重組禽流感滅活疫苗免疫效力。根據(jù)雞白介素2受體alpha鏈(ChlL2Ra)eDNA序列設(shè)計(jì)多對(duì)引物探針，結(jié)合RACE技術(shù)克隆了duIL2受體alphaeDNA(命名為DuCD25或者dulL一2Ra)?？寺〉膃DNA序列長(zhǎng)886bp，其eDNA編碼一條由226個(gè)氮基酸組成的前體蛋白，該前體蛋白含有由20∞殘基構(gòu)成的信號(hào)肽序列；預(yù)測(cè)的dulL2Ra成熟蛋白與雞IL2Ra同源性61％，與哺乳類(lèi)同系

3、物同源性在1525％之間。對(duì)lO個(gè)物種IL2Ra氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)禽類(lèi)和哺乳類(lèi)有23個(gè)越對(duì)應(yīng)位點(diǎn)完全保守。dulL2Ra的8個(gè)半胱氨酸殘基中，有7個(gè)對(duì)應(yīng)位點(diǎn)與雞和哺乳類(lèi)完全保守；我們也發(fā)現(xiàn)，哺乳類(lèi)IL2Rtt的P24一P25、N90A91、P11lK112、1185R186位點(diǎn)之間和胞內(nèi)羧基末端，在進(jìn)化過(guò)程中分別出現(xiàn)了l，3，1、2629和916個(gè)氨基酸插入現(xiàn)象，然而在進(jìn)化過(guò)程中，哺乳類(lèi)IL2Ra并沒(méi)有發(fā)生任何aa殘基缺失的現(xiàn)象。二級(jí)結(jié)

4、構(gòu)分析表明dulL2Ra成熟蛋白羧基末端含有25個(gè)氪基酸殘基(182206)構(gòu)成的跨膜區(qū)。將dulL2Ra胞外鏈PCR產(chǎn)物亞克隆入原核表達(dá)載體pET32a，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET32adulL2Ra，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了duIL2Ra蛋白在大腸桿菌的表達(dá)。SDSPAGE和Westernblot分析顯示。表達(dá)蛋白的分子量約為40KDa，可以被antiHis單克隆抗體識(shí)別?？扇苄苑治霰砻?，經(jīng)pET32a系統(tǒng)表

5、達(dá)的dulL2Ra主要以包涵體的形式存在。表達(dá)的重組蛋白經(jīng)NP層析柱變性純化產(chǎn)率極低，采用制備包涵體的方法，每升培養(yǎng)液中可獲得32ragrdulL2Ra蛋白粗制品。用純化的rdulL2Ra包涵體蛋白作為抗原免疫BALB／e小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合，雜交瘤細(xì)胞篩選，有限稀釋法克隆，最終獲得15株持續(xù)、穩(wěn)定分泌抗rdulL2Ra原核表達(dá)產(chǎn)物的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1A4。386，7C8，IC5。3DI，IFA，2El，6El，6E9，2

6、F4，6I：2，4010，3H11，4H3，6H7(抗體類(lèi)型均為IgGl的。對(duì)15株單抗Westernblot鑒定結(jié)果表明。與rdulL2Ra均具有反應(yīng)性。細(xì)胞免疫化學(xué)分析表明，僅有5株(1A4，3H11，4G10，3DI，6F2)能夠特異識(shí)別經(jīng)Veto細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)的dulL2Ra蛋白。進(jìn)一步利用ConA誘導(dǎo)的內(nèi)源性duIL2Ra作為抗原篩選到兩株能夠識(shí)別dulL2Ra天然表位的抗體(3HII，6F2)利用H9N2亞型禽流感病毒感染模型

7、，以rdulL2Ra單克隆抗體6F2為檢測(cè)抗體。借助流式細(xì)胞術(shù)。研究了鴨DuCD25細(xì)胞在病毒感染免疫應(yīng)答中的表達(dá)動(dòng)態(tài)結(jié)果表明健康鴨脾細(xì)胞僅有少量DuCD25細(xì)胞(4％)而感染鴨脾細(xì)胞中的DuCD25細(xì)胞比率以固定斜率直線式迅速上調(diào)，到48h達(dá)到峰值，隨后逐漸下降。至感染后144h降至正常水平，說(shuō)明DuCD25細(xì)胞在機(jī)體抗病毒感染的免疫應(yīng)答過(guò)程中扮演著重要角色。關(guān)鍵詞：鴨；dulL2；DuCD25t原核表達(dá)：復(fù)性；副作用：淋巴細(xì)胞增殖；