雞白細(xì)胞介素2 ELISA檢測技術(shù)研究.pdf

1、白細(xì)胞介素2(Interleukin2，IL-2)是在分裂素或特異性抗原刺激下，主要由激活的T淋巴細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞系產(chǎn)生的一類具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子。在養(yǎng)禽業(yè)中，一些病原如傳染性法氏囊病毒等感染后，可引起免疫抑制，這種免疫抑制大多伴隨著IL-2的分泌異常或者對IL-2的反應(yīng)異常。因此在不同生理狀態(tài)下測定IL-2水平，對于了解機(jī)體的免疫狀態(tài)很有意義，甚至可以作為一個診斷指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Bac-To-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)雞IL-

2、2(chIL-2)蛋白，意欲在此基礎(chǔ)上建立重組chIL-2蛋白的ELISA檢測技術(shù)。
　　 1.通過PCR克隆chIL-2蛋白基因(chIL-2)，并克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體質(zhì)粒pFastBacHTB，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac/AcNPV感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)三重抗性和藍(lán)白斑篩選后，獲得chIL-2的桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒rBacmid-AcNPV-chIL-2。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞后，包裝成重組桿狀病毒AcNPV-chIL-2，重

3、組桿狀病毒在Sf9細(xì)胞上出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變。IFA檢測結(jié)果顯示，當(dāng)感染細(xì)胞用鼠抗chIL-2蛋白單克隆抗體檢測時，能出現(xiàn)特異性的綠色熒光。SDS-PAGE和Western-blot分析顯示，chIL-2蛋白以胞內(nèi)方式進(jìn)行表達(dá)，并能與鼠抗chIL-2蛋白單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，表達(dá)蛋白的相對分子量為20kD。
　　 2.用鎳柱純化的Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的chIL-2蛋白為標(biāo)準(zhǔn)待檢抗原，鼠抗chIL-2單克隆抗體

4、8H8和兔抗chIL-2的多克隆抗體分別為包被抗體和檢測抗體，進(jìn)行chIL-2抗原捕獲ELISA反應(yīng)條件的篩選。優(yōu)化的反應(yīng)體系為：單克隆抗體8H8包被濃度為600ng/ml，檢測抗體兔抗chIL-2IgG濃度為1.25μg/ml，封閉液為5％脫脂奶/PBS，抗原作用時間為37℃90min，酶標(biāo)抗體反應(yīng)條件為37℃60min，底物溶液顯色條件為37℃顯色40min。該體系的檢測限為1.56ng/ml。
　　 3.應(yīng)用建立的chIL

5、-2抗原捕獲ELISA方法對ConA刺激SMC分泌和H9N2流感病毒雞感染條件下的chIL-2進(jìn)行分析，結(jié)果表明，沒有ConA激活的脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中chIL-2的分泌量僅為5.15±0.38ng/ml以內(nèi)，ConA激活的脾淋巴細(xì)胞48h培養(yǎng)上清中能檢測出chIL-2為45.56±1.28ng/ml。H9N2感染24小時狀態(tài)下，血清中chIL-2為1.81±0.67ng/ml，120小時為9.55±1.72ng/ml，144小時為3.