白細(xì)胞介素6及其受體在綿羊早期胚胎中的表達(dá)和作用研究.pdf

1、細(xì)胞因子及其受體在哺乳動(dòng)物胚胎和同一時(shí)期母體中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)模式近年來得到了廣泛的研究，對(duì)其在胚胎發(fā)生過程中功能的發(fā)揮以及調(diào)節(jié)有了深入的了解。白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)是一種多功能的細(xì)胞因子，有研究表明在生理狀況下IL-6參與調(diào)節(jié)排卵、著床、胚胎發(fā)育等生殖過程。本研究通過免疫熒光化學(xué)、實(shí)時(shí)定量PCR及蛋白印跡檢測(cè)等分子生物學(xué)技術(shù)，結(jié)合體外受精技術(shù)，觀察了白細(xì)胞介素6及其受體在綿羊卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育過程中的表

2、達(dá)情況；在發(fā)育培養(yǎng)液中添加不同劑量的IL-6，觀察了其對(duì)卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育的影響；并采用RNAi技術(shù)，對(duì)綿羊體外受精卵進(jìn)行siRNA注射，進(jìn)一步探討IL-6及其受體在綿羊早期胚胎發(fā)育中的作用，為研究綿羊胚胎早期發(fā)育機(jī)理提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。
　　 一IL-6和IL-6R在綿羊卵母細(xì)胞和體外受精早期胚胎中的表達(dá)
　　 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，IL-6和IL-6RmRNA在綿羊卵母細(xì)胞和體外受精胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期中均有表達(dá)。在

3、卵母細(xì)胞成熟過程中，IL-6在成熟培養(yǎng)4h呈現(xiàn)顯著升高，隨后則降低，而在16-20h時(shí)重新升高；IL-6R在成熟培養(yǎng)早期(0h-8h)表達(dá)量較高，4h最高，之后降低。在體外受精胚胎發(fā)育過程中，IL-6在2-細(xì)胞期胚胎中表達(dá)量低，到桑椹胚和囊胚期時(shí)達(dá)到最高，分別是2-細(xì)胞期含量的3.51倍、5.16倍、26.10倍和43.16倍。IL-6R與IL-6表達(dá)模式相似，在2-細(xì)胞期的表達(dá)量較低，在桑椹胚和囊胚中的表達(dá)量較高且差異顯著。
　

4、　 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，在綿羊卵母細(xì)胞和體外受精的各個(gè)發(fā)育時(shí)期的胚胎中，IL-6和IL-6R蛋白均有表達(dá)，在體外成熟過程中IL-6和IL-6R表達(dá)部位基本一致，并主要分布在細(xì)胞膜區(qū)域及膜下區(qū)域，在細(xì)胞質(zhì)中分布很少，而在細(xì)胞核中未檢測(cè)到；在早期胚胎發(fā)育過程中，IL-6中主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，而IL-6R則集中在細(xì)胞膜附近。通過蛋白印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IL-6和IL-6R蛋白在綿羊卵母細(xì)胞和體外受精胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期中均有表達(dá)且表達(dá)規(guī)律與其轉(zhuǎn)錄水

5、平相似。在綿羊卵母細(xì)胞成熟過程中，IL-6和IL-6R蛋白的相對(duì)表達(dá)量在成熟培養(yǎng)4h左右呈現(xiàn)顯著升高，隨后則降低；而在20-24h時(shí)卵母細(xì)胞中IL-6的表達(dá)重新升高；在早期胚胎中其表達(dá)量較低，在桑椹胚和囊胚中的表達(dá)量較高，且差異顯著。
　　 二IL-6對(duì)綿羊早期胚胎發(fā)育的影響
　　 在成熟培養(yǎng)液中分別添加10、50、100ng/mL的重組人IL-6，不添加IL-6組為對(duì)照組，另一個(gè)對(duì)照組用10％發(fā)情羊血清(OES)代替B

6、SA。結(jié)果表明添加10ng/mLIL-6與BSA對(duì)照組相比可顯著提高核成熟率(P<0.05)，與OES組成熟率相近，但不影響后續(xù)體外受精胚胎的發(fā)育率。添加50ng/mLIL-6成熟率與BSA對(duì)照組相比變化不大。而添加100ng/mLIL-6使核成熟率，囊胚率和孵化囊胚顯著降低(P<0.05)。結(jié)果表明低濃度的IL-6可能促進(jìn)了卵母細(xì)胞的核成熟，而高濃度對(duì)卵母細(xì)胞成熟和之后胚胎發(fā)育有一定的抑制作用。
　　 發(fā)育培養(yǎng)液中分別添加10

7、、50、100ng/mL的重組人IL-6，不添加IL-6組為對(duì)照組。結(jié)果表明添加10ng/mLIL-6組卵裂率顯著升高(P<0.05)，而添加100ng/mLIL-6組卵裂率、囊胚率和孵化囊胚顯著降低(P<0.05)。推測(cè)低濃度的IL-6可能對(duì)于胚胎發(fā)育有一定的促進(jìn)作用。而添加100ng/mLIL-6嚴(yán)重影響了綿羊早期胚胎的發(fā)育，可能高濃度的IL-6對(duì)于胚胎發(fā)育有一定毒性。
　　 三發(fā)育培養(yǎng)液中添加IL-6對(duì)IL-6和IL-6R

8、相對(duì)表達(dá)量的影響
　　 在發(fā)育培養(yǎng)液中分別添加10、50、100ng/mL的IL-6，添加組與對(duì)照組相比發(fā)現(xiàn)胚胎中IL-6mRNA含量明顯增加(P<0.05)，而IL-6RmRNA表達(dá)量到桑椹胚和囊胚期才有明顯的增加(P<0.05)。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組相比，胚胎中IL-6和IL-6R蛋白表達(dá)量均有增加，50ng/mL添加組蛋白含量增加明顯。四顯微注射IL-6dsRNA對(duì)IL-6和IL-6R相對(duì)表達(dá)量的影響
　　

9、將IL-6siRNA和Non-TargetingsiRNA分別注入綿羊體外受精卵，以未注射組為對(duì)照組。IL-6siRNA注射組、Non-TargetingsiRNA注射組和未注射對(duì)照組的卵裂率分別為77.07%、76.81%、78.05%，siRNA處理組與Non-TargetingsiRNA注射組和未注射組之間囊胚發(fā)育率無顯著差異(P<0.05)，表明IL-6的降低對(duì)于綿羊早期胚胎的發(fā)育沒有明顯影響。
　　 通過Real-ti

10、mePCR方法檢測(cè)，與對(duì)照組相比，當(dāng)胚胎發(fā)育到桑椹胚期時(shí)IL-6mRNA含量下降了69.63%，而到囊胚期時(shí)IL-6及IL-6RmRNA含量分別下降了87.45%和71.77%；而Non-TargetingsiRNA的IL-6和IL-6RmRNA含量與未注射的對(duì)照組基本一致。同時(shí)檢測(cè)到作為對(duì)照的β-actin基因的mRNA水平則在各組中基本保持一致，表明體外合成的siRNA并未對(duì)其它對(duì)照基因mRNA的表達(dá)產(chǎn)生影響，能夠特異而有效的降低目

11、的基因的水平。
　　 蛋白免疫印跡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，注射siRNA的方法有效消減了IL-6的蛋白水平，從8-cell到囊胚期干擾效果明顯，IL-6R蛋白也隨著IL-6下降而下降。因此，向綿羊體外受精卵中注射IL-6siRNA能夠使IL-6和IL-6R的mRNA及蛋白含量下降并持續(xù)到囊胚期。
　　 綜上所述，IL-6和IL-6R在綿羊體外受精胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，其分布有規(guī)律性。在成熟培養(yǎng)液中添加10ng/mLIL-