適宜于HBV感染的新型細(xì)胞模型的研究.pdf

1、研究背景: 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是嗜肝DNA病毒屬的一員。HBV可以引起肝臟的急、慢性感染，HBV的慢性感染是引起嚴(yán)重肝臟疾病（比如：肝硬化、肝細(xì)胞肝癌）的主要病因。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球20多億人曾感染乙肝病毒，其中3.5億以上為慢性乙型肝炎病毒感染者。慢性乙型肝炎不易徹底治愈，并且具有發(fā)展成肝硬化、肝癌的高度危險(xiǎn)性。每年全世界范圍內(nèi)約有一百萬人死于慢性乙型肝炎感染所致的肝衰竭、肝硬化和

2、肝細(xì)胞肝癌。我國約有超過50％的居民曾被乙肝病毒感染過，其中8％～15％的人成為慢性感染者。 自從1965年Blumberg等發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒表面抗原，到1997年乙肝病毒全基因組的克隆和測序完成，人們對HBV的基因組成、抗原結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性及其生命周期的認(rèn)識迅速發(fā)展。但是由于嗜肝DNA病毒屬的感染具有嚴(yán)格的宿主特異性和組織特異性，限制了適合于研究人HBV感染的體外細(xì)胞模型的建立。 目前，用于體外研究HBV的細(xì)胞模型主要

3、是人原代肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞來源的細(xì)胞系。人原代肝細(xì)胞用于HBV感染研究有其特有的優(yōu)勢：人原代肝細(xì)胞保留了分化肝細(xì)胞的重要細(xì)胞學(xué)特性，允許HBV的自然穿入和完整復(fù)制。然而，其缺陷在于在體外培養(yǎng)幾天后，原代肝細(xì)胞開始出現(xiàn)肝細(xì)胞特殊形態(tài)的消失，并且失去了對HBV的感染和復(fù)制能力。此外，人原代肝細(xì)胞必須由新鮮肝臟組織獲得，來源有限，并且其對病毒的攝取能力還受到細(xì)胞生長狀態(tài)的影響。人原代肝細(xì)胞培養(yǎng)因?yàn)榇嬖谏鲜隼щy而限制了其應(yīng)用，對HBV的研究更多的

4、依賴于轉(zhuǎn)染了HBV DNA克隆的分化良好的肝癌細(xì)胞系。其中最常用的是HepG2.2.15細(xì)胞系，HepG2.2.15細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了完整的HBV基因組，表達(dá)HBV RNA、病毒蛋白并能產(chǎn)生病毒樣顆粒。由HepG2.2.15細(xì)胞分泌的病毒顆粒已經(jīng)被證實(shí)可以感染黑猩猩。目前我們對于HBV復(fù)制和病毒基因組組成的許多重要的知識都是通過對轉(zhuǎn)染了HBV DNA的肝癌細(xì)胞系的研究獲得的。但是，由于HBV基因組是通過轉(zhuǎn)染而非自然感染的方式進(jìn)入到細(xì)胞中的，

5、這些轉(zhuǎn)染了HBV DNA的肝癌細(xì)胞系不能用于對HBV感染宿主細(xì)胞的早期感染過程的研究，包括病毒吸附，穿入和脫殼等過程。 由于缺乏有效的體外病毒感染和復(fù)制模型系統(tǒng)，HBV感染肝臟的早期機(jī)制研究進(jìn)展較為緩慢，從而在一定程度上影響了乙型肝炎及其相關(guān)肝臟疾病的基礎(chǔ)和臨床研究。本研究旨在建立一個(gè)適合于HBV自然感染，并能有效進(jìn)行病毒復(fù)制的細(xì)胞模型，為HBV感染宿主細(xì)胞的早期機(jī)制，以及病毒侵入人肝細(xì)胞后完整的復(fù)制過程的研究提供一個(gè)有用的研究

6、工具。 具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下： 第一部分雜交細(xì)胞株HepCHLine-4的建立 目的: 建立人原代肝細(xì)胞與HepG2的雜交細(xì)胞，以作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。 方法: 1.建立人原代肝細(xì)胞與HepG2的雜交細(xì)胞。 1.1利用化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生次黃嘌呤烏嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）基因突變。 1.2人原代肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)，臺盼藍(lán)染色排除法確定肝細(xì)胞存活率。

7、 1.3利用細(xì)胞融合技術(shù)，將篩選出的HGPRT缺陷的HepG2細(xì)胞（HGPRT-HepG2細(xì)胞）與人原代肝細(xì)胞進(jìn)行融合，經(jīng)HAT培養(yǎng)基篩選出異核體雜交細(xì)胞，進(jìn)而用有限稀釋法進(jìn)行單克隆。 1.4利用胰蛋白酶G顯帶技術(shù)對所得細(xì)胞進(jìn)行核型分析。 1.5繪制雜交細(xì)胞生長曲線。 2.對雜交細(xì)胞是否攜帶HBV基因進(jìn)行檢測。 因?yàn)楸狙芯恐腥诤铣晒Φ碾s交細(xì)胞是用慢性乙型肝炎攜帶者的肝細(xì)胞與HepG2細(xì)胞融合所得，所以在進(jìn)

8、行HBV感染實(shí)驗(yàn)之前我們對雜交細(xì)胞是否攜帶HBV基因進(jìn)行檢測。 2.1合成HBV型特異性引物，用巢式PCR檢測雜交細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)上清中是否存在HBVDNA。 2.2提取雜交細(xì)胞基因組DNA，綠豆核酸酶消化后，巢式PCR檢測雜交細(xì)胞內(nèi)是否存在HBV的復(fù)制中間產(chǎn)物HBV cccDNA。 2.3雜交細(xì)胞是否表達(dá)HBV特異性蛋白抗原：間接免疫熒光檢測雜交細(xì)胞內(nèi)是否有HBcAg的表達(dá)；電化學(xué)發(fā)光法檢測雜交細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HB

9、sAg和HBeAg。 結(jié)論: 1.成功建立了一個(gè)兼具有HepG2和人原代肝細(xì)胞遺傳特性的雜交細(xì)胞株HepCHLine-4，可以進(jìn)一步用來研究建立適宜于HBV感染的細(xì)胞模型。 2.雜交細(xì)胞HepCHLine-4雖然是由慢性乙型肝炎攜帶者肝細(xì)胞與HepG2細(xì)胞融合所得，但是并不攜帶HBV基因及HBV的復(fù)制中間產(chǎn)物，故可以用于HBV感染的實(shí)驗(yàn)研究。 第二部分評價(jià)雜交細(xì)胞株HepCHLine-4對HBV的自然感染

10、能力 目的: 用慢性乙型肝炎患者血清中的病毒顆粒自然感染雜交細(xì)胞，評價(jià)雜交細(xì)胞對HBV的自然感染能力，探討雜交細(xì)胞株HepCHLine-4用作HBV感染細(xì)胞模型的可能性。 方法: 1.用含HBV DNA的慢性乙型肝炎患者血清分別與雜交細(xì)胞HepCHLine-4和HepG2細(xì)胞共同孵育，感染細(xì)胞，HepG2細(xì)胞作為對照細(xì)胞。 2.用HBV型特異性引物，巢式PCR檢測感染后細(xì)胞HBV DNA合成及分泌

11、情況。 3.提取感染后細(xì)胞基因組DNA，綠豆核酸酶消化后，巢式PCR檢測感染后細(xì)胞內(nèi)有無HBV復(fù)制中間產(chǎn)物HBV cccDNA。 4.感染后雜交細(xì)胞中HBV特異性蛋白合成及分泌能力的檢測：間接免疫熒光檢測感染后細(xì)胞內(nèi)是否有HBcAg的表達(dá)；電化學(xué)發(fā)光法檢測感染后細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HBsAg和HBeAg。 5.電鏡檢查感染后細(xì)胞能否向培養(yǎng)上清中分泌HBV病毒顆粒。 結(jié)論: 雜交細(xì)胞HepCHLine-

12、4可以被慢性乙型肝炎患者血清中的HBV病毒自然感染，感染后病毒可以侵入雜交細(xì)胞并在雜交細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行病毒基因的復(fù)制，形成復(fù)制中間產(chǎn)物HBV cccDNA；并且進(jìn)一步進(jìn)行病毒基因的表達(dá)，合成HBV特異性蛋白HBsAg、HBeAg和HBcAg：HBV感染后雜交細(xì)胞能合成子代病毒顆粒并分泌出細(xì)胞。 到目前為止，經(jīng)過了一年多的凍存復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)，雜交細(xì)胞HepCHLine-4已經(jīng)傳代50代次以上，細(xì)胞形態(tài)和生長特性沒有明顯改變，并且保持其對