DRibbles(HBV+)疫苗治療HBV感染的實驗研究.pdf

1、來源于腫瘤細胞或者病毒感染細胞的自噬小體在腫瘤及病毒抗原的交叉遞呈過程中發(fā)揮了重要作用[1]。采用專利技術(shù)從轉(zhuǎn)染HBV的細胞HepG2.2.15中提取的自噬小體類疫苗即DRibbles(HBV+)疫苗，含有豐富的HBV抗原組分，其雙層膜結(jié)構(gòu)特點也大大地增強其被抗原提呈細胞攝取的可能。
　　Chen等[2]建立的HBV持續(xù)感染FVB/N小鼠模型，其HBV抗原可高水平維持50周以上，是理想的模擬HBV慢性感染的小鼠模型。本研究擬采用該

2、模型探討DRibbles(HBV+)疫苗對HBV感染的治療作用。
　　目的:
　　以DRibbles(HBV+)疫苗作為治療性疫苗，以持續(xù)感染HBV的FVB/N小鼠為動物模型，探討DRibbles(HBV+)疫苗對HBV急性與慢性感染的治療作用及其增強策略。
　　方法:
　　1.HBV感染小鼠模型的建立及DRibbles(HBV+)疫苗誘導(dǎo)野生型小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答的實驗研究
　　1.1尾靜脈高壓注射法注射pG

3、EM4Z/HBV1.3質(zhì)粒于FVB/N小鼠和Balb/c小鼠，ELISA法定期檢測血清中HBeAg水平，免疫組織化學染色法分析肝臟細胞HBcAg表達，以監(jiān)測HBV感染情況;
　　1.2選取野生型FVB/N小鼠，淋巴結(jié)注射30μg DRibbles(HBV+)疫苗進行初免，3天后肌肉注射混有1mg納米鋁佐劑和30μg DRibbles(HBV+)疫苗的100μl PBS懸液進行加強免疫，3天后再以同樣方法加強一次。并以PBS與無HB

4、V抗原的DRibbles(HBV-)免疫小鼠作為對照。末次免疫后第7天取脾臟淋巴細胞并以HBsAg190-197和HBcAg129-140抗原肽體外刺激48h，ELISA法測上清IFN-γ含量。
　　2.DRibbles(HBV+)疫苗治療HBV急性感染的實驗研究
　　2.1于FVB/N小鼠感染HBV第5天，按照前述淋巴結(jié)注射進行淋巴結(jié)初免后2次肌肉注射再加強的治療方法進行DRibbles(HBV+)疫苗免疫，同時以PBS與

5、DRibbles(HBV-)免疫治療作為對照。定期檢測血清中HBeAg、ALT;
　　2.2第18天取脾臟淋巴細胞加入HBsAg190-197和HBcAg129-140抗原肽體外刺激48h， ELISA法檢測上清中IFN-γ含量;
　　2.3第32天取肝臟組織，免疫組化技術(shù)分析HBcAg+肝細胞的比例，HE染色分析肝臟病理變化。
　　3.DRibbles(HBV+)疫苗治療HBV慢性感染的實驗研究
　　3.1于F

6、VB/N小鼠感染HBV第8周，參照前述方法實施DRibbles(HBV+)疫苗免疫治療，同時以PBS與DRibbles(HBV-)免疫治療作為對照。定期檢測血清中HBeAg水平;
　　3.2第10周取脾臟淋巴細胞加入HBsAg190-197和HBcAg129-140抗原肽體外刺激48h，ELISA法檢測上清中IFN-γ含量。
　　4.DRibbles((HBV+)疫苗聯(lián)合B/DRibbles(HBV+)治療HBV慢性感染的研

7、究
　　4.1 FVB/N小鼠感染HBV第8周時，淋巴結(jié)注射DRibbles(HBV+)疫苗進行初次免疫治療，并以PBS與DRibbles(HBV-)免疫治療作為對照。3天后，尾靜脈注射法進行B細胞負載DRibbles疫苗的加強治療。定期檢測血清中HBeAg水平;
　　4.2第10周取脾臟淋巴細胞加入HBsAg190-197和HBcAg129-140抗原肽體外刺激48h，ELISA法檢測上清中IFN-γ含量。第12周取肝臟組

8、織，免疫組化技術(shù)分析HBcAg+肝細胞的比例。
　　5.DRibbles(HBV+)疫苗聯(lián)合PD-1、CTLA-4封閉性抗體治療HBV慢性感染的研究
　　5.1 FVB/N小鼠感染HBV第7周時，檢測小鼠血清HBeAg水平并隨機分為4組:①PBS對照組;②DRibbles(HBV+)治療組;③αPD-1、αCTLA-4治療組;④DRibbles(HBV+)聯(lián)合αPD-1、αCTLA-4治療組。參照前述方法于第8周對②④組小鼠

9、進行DRibbles(HBV+)疫苗3次治療。于治療期一段時間內(nèi)對③④組小鼠腹腔注射αPD-1(200μg/只)和αCTLA-4（100μg/只）。定期檢測血清中HBeAg、ALT;
　　5.2第10周時取各組小鼠脾臟淋巴細胞體外加抗原肽刺激48h，ELISA法檢測上清中IFN-γ含量;
　　5.3第12周取各組小鼠肝臟組織，免疫組化法分析其中HBcAg+肝細胞的比例，HE染色分析肝臟病理變化。
　　結(jié)果:
　　

10、1.HBV感染小鼠模型的建立及DRibbles(HBV+)疫苗誘導(dǎo)野生型小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答的
　　實驗研究
　　1.1 FVB/N小鼠血清HBeAg水平能夠持續(xù)存在18周，7只小鼠中有2只出現(xiàn)降低。而Balb/c對照組小鼠血清HBeAg到第6周已基本為陰性;
　　1.2第18周，F(xiàn)VB/N小鼠肝內(nèi)仍有大量HBcAg+細胞存在，而Balb/c小鼠HBcAg+肝細胞到第4周明顯較少。HE染色顯示，兩組小鼠肝組織均未見明顯病變

11、，F(xiàn)VB/N小鼠肝內(nèi)查見炎性細胞浸潤。提示該模型能夠模擬臨床HBV慢性感染;
　　1.3各組小鼠淋巴細胞經(jīng)HBsAg190-197和HBcAg129-140刺激后，與PBS對照組、DRibbles(HBV-)組相比，DRibbles(HBV+)免疫組上清中IFN-γ含量均有顯著升高(HBsAg190-197刺激:600 vs50，600 vs15，HBcAg129-140刺激:450vs15，450vs20，pg/ml)。

12、　　2.DRibbles(HBV+)疫苗治療HBV急性感染的實驗研究
　　2.1第32天DRibbles(HBV-)組血清HBeAg與PBS組相比沒有顯著變化(p=0.114)。但DRibbles(HBV+)組血清HBeAg與DRibbles(HBV-)組相比顯著降低(S/CO:1.38 vs6.57，p＜0.05)。第18天DRibbles(HBV+)組小鼠血清中ALT顯著高于PBS組和DRibbles(HBV-)組(122.7

13、 vs53.3,U/L,p＜0.05;122.7 vs48.0,U/L,p＜0.05)，而第32天DRibbles(HBV+)組小鼠血清中ALT下降至對照組同等水平;
　　2.2各組小鼠淋巴細胞經(jīng)HBsAg190-197和HBcAg129-140刺激后，與PBS對照組、DRibbles(HBV-)組相比，DRibbles(HBV+)免疫組上清中IFN-γ含量均有顯著升高(HBsAg190-197刺激:910 vs60，910 vs

14、70，HBcAg129-140刺激:850 vs55，850vs1000，pg/ml);
　　2.3第32天，DRibbles(HBV+)免疫組與PBS組、DRibbles(HBV-)組相比，肝內(nèi)HBcAg+肝細胞的比例明顯降低(3％ vs15％，p＜0.05;3％ vs13％，p＜0.05)。HE結(jié)果顯示，各組小鼠肝內(nèi)均未見明顯病變，DRibbles(HBV+)組小鼠肝組織內(nèi)查見輕微壞死。提示:DRibbles(HBV+)疫苗對

15、HBV急性感染具有治療作用。
　　3.DRibbles(HBV+)疫苗治療HBV慢性感染的實驗研究
　　3.1第12周，DRibbles(HBV+)免疫組血清HBeAg水平與PBS組、DRibbles(HBV-)免疫組相比均無差異(p=0.219，p=0.295);
　　3.2 ELISA結(jié)果顯示，DRibbles(HBV+)免疫組小鼠淋巴細胞經(jīng)HBsAg190-197和HBcAg129-140刺激后，其培養(yǎng)上清中IF

16、N-γ含含量分別為80pg/ml、55pg/ml。提示:DRibbles(HBV+)疫苗對HBV慢性感染小鼠的治療效果不明顯。
　　4.DRibbles(HBV+)疫苗聯(lián)合B/DRibbles(HBV+)治療HBV慢性感染的研究
　　4.1第12周時，B/DRibbles(HBV+)免疫組小鼠血清HBeAg水平與PBS對照組、B/DRibbles(HBV-)對照組相比均無差異(p=0.076，p=0.489);
　　4

17、.2 ELISA結(jié)果顯示，DRibbles(HBV+)免疫組小鼠淋巴細胞經(jīng)HBsAg190-197和HBcAg129-140刺激后，其培養(yǎng)上清中IFN-γ含量分別為45pg/ml、22pg/ml。而B/DRibbles(HBV+)免疫組小鼠、PBS組與B/DRibbles(HBV-)對照組小鼠肝內(nèi)HBcAg+肝細胞的比例無差異(13％ vs15％ vs13.4％)。提示:DRibbles(HBV+)疫苗聯(lián)合B/DRibbles(HBV+

18、)對HBV慢性感染小鼠的治療效果仍然不明顯。
　　5.DRibbles(HBV+)疫苗聯(lián)合PD-1、CTLA-4封閉性抗體治療HBV慢性感染的研究
　　5.1第12周，聯(lián)合治療組（組④）血清HBeAg水平與PBS組（組①）相比明顯降低(2.12 vs7.14，S/CO，p＜0.05)，而組①/組②/組③之間均無差異。第10周，聯(lián)合治療組（組④）血清中ALT高于PBS組（組①）（110 vs54.7，U/L，p＜0.05），組

19、①/組②/組③之間均無差異。第12周時，聯(lián)合治療組（組④）小鼠血清中ALT下降至對照組同等水平;
　　5.2 ELISA結(jié)果顯示，DRibbles(HBV+)免疫組小鼠淋巴細胞經(jīng)HBSAg190-197和HBcAg129-140刺激后，其培養(yǎng)上清中IFN-γ含量平均水平分別為267pg/ml、150pg/ml，與其他各對照組相比均存差異性;
　　5.3第12周，聯(lián)合治療組（組④）與PBS組（組①）相比，肝內(nèi)HBcAg+肝細胞

20、的比例明顯降低(6％ vs14％，p＜0.05)，組①/組②/組③之間均無差異。HE結(jié)果顯示，各組小鼠肝內(nèi)均未見嚴重病變，肝內(nèi)可見炎性細胞浸潤與肝細胞變性發(fā)生，聯(lián)合治療組（組④）小鼠肝內(nèi)查見片狀壞死。提示:DRibbles(HBV+)疫苗聯(lián)合PD-1、CTLA-4封閉性抗體對HBV慢性感染具有治療作用。
　　結(jié)論:
　　DRibbles(HBV+)疫苗對HBV急性感染的具有明顯的治療效果，但對HBV慢性感染的治療效果不明顯;