慢性HBV感染誘導(dǎo)miR-146a對(duì)NK細(xì)胞功能負(fù)調(diào)控機(jī)制及防治HBV疫苗新策略探究.pdf

1、研究目的：乙型肝炎病毒(HBV)的感染是威脅全人類健康的重大傳染性疾病，目前全球有約3.5億人感染乙肝病毒。由于HBV病毒本身的特點(diǎn)和治療藥物的相對(duì)匱乏和應(yīng)用上的諸多局限，HBV感染人群中有三分之二是慢性乙肝患者，病毒的徹底清除十分困難，疾病遷延不愈引發(fā)的肝纖維化、肝硬化和肝癌等并發(fā)癥更是患者健康的重大威脅。因此，乙肝發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)生物學(xué)和免疫治療學(xué)一直是肝臟病學(xué)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。
　　研究表明，導(dǎo)致慢性乙肝患者長期攜帶病毒，對(duì)抗病

2、毒藥物應(yīng)答不充分的關(guān)鍵原因之一是患者體內(nèi)的免疫系統(tǒng)長期處于抑制和耐受狀態(tài)。肝臟免疫學(xué)研究認(rèn)為HBV病毒可在器官、細(xì)胞、分子等多個(gè)層次上抑制機(jī)體的抗HBV免疫反應(yīng)。由于HBV病毒的有效清除離不開免疫系統(tǒng)的激活，所以打破和逆轉(zhuǎn)HBV造成的免疫耐受狀態(tài)，活化機(jī)體的抗病毒免疫應(yīng)答是慢性乙肝治療的重點(diǎn)和關(guān)鍵。
　　在抗HBV應(yīng)答過程中，固有免疫是機(jī)體抵抗HBV感染的第一道防線。其中，NK細(xì)胞在HBV感染時(shí)能快速募集到感染部位，無需抗原遞呈就

3、能識(shí)別病毒感染的細(xì)胞并予以殺傷，在HBV感染早期發(fā)揮著快速清除病毒、防止病毒集聚和擴(kuò)散的作用。而獲得性免疫應(yīng)答是機(jī)體抵抗HBV感染的中堅(jiān)力量，尤其是HBV特異性CD8+T細(xì)胞，是清除肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA最主要的免疫細(xì)胞。然而持續(xù)的HBV復(fù)制損害了CD8+T細(xì)胞的功能，抑制了NK細(xì)胞的殺傷活力，同時(shí)削弱了它們分泌IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子的能力，這兩大類細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞功能的缺失嚴(yán)重延遲了患者體內(nèi)病毒的清除速度，影響了慢性乙

4、肝的轉(zhuǎn)歸。
　　本研究的目的是從固有免疫成員NK細(xì)胞和獲得性免疫成員T細(xì)胞兩方面著手，探索慢性乙肝耐受的機(jī)制及新治療策略。一方面，我們以CHB患者為對(duì)象，在表觀遺傳學(xué)層面上研究HBV感染過程中miR-146a調(diào)控NK細(xì)胞功能的機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)miR-146a在NK細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮負(fù)調(diào)作用，描繪了miR-146a在NK中受到調(diào)節(jié)的基本路徑和發(fā)揮作用的靶分子;通過靶向調(diào)控miR-146a的表達(dá)可增強(qiáng)NK細(xì)胞的功能，達(dá)到治療慢性乙肝的目

5、的。這部分旨在通過改善固有免疫應(yīng)答來針對(duì)性地治療慢性乙肝，為設(shè)計(jì)開發(fā)基于miRNA的新型慢性乙肝治療藥物提供理論依據(jù)。另一方面，我們?cè)O(shè)計(jì)并驗(yàn)證了一種新的乙肝疫苗及其免疫接種策略，采用淋巴結(jié)定向注射HBsAg的方法，以促進(jìn)抗原與抗原遞呈細(xì)胞的充分接觸為目的，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答，從而提高機(jī)體抗HBV獲得性免疫應(yīng)答和免疫記憶的形成。我們利用HBV模型小鼠對(duì)這種疫苗的治療效果進(jìn)行了檢測(cè)和評(píng)價(jià)，并探索了其發(fā)揮作用的免疫學(xué)機(jī)制，并且淋巴結(jié)定向

6、注射HBsAg的方法也可以用于預(yù)防性疫苗，從而為慢性乙肝的防治提供一種新的技術(shù)手段。
　　研究方法：第一部分 miR-146a通過靶向STAT1負(fù)調(diào)NK功能。
　　首先，我們運(yùn)用MACS磁珠分選CHB和HCC患者外周血中NK細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)確定細(xì)胞純度后，利用LDH法檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞的殺傷活性，同時(shí)運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)這些NK細(xì)胞中miR-146a的表達(dá)水平。在初步看到miR-146a的作用后，構(gòu)建m

7、iR-146a過表達(dá)、抑制及其對(duì)照的慢病毒載體，通過慢病毒感染的方法將miR-146a過表達(dá)及抑制載體轉(zhuǎn)入NK-92細(xì)胞系或者原代NK細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選一周后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞陽性率，通過定量PCR檢測(cè)過表達(dá)效率。而原代NK細(xì)胞則是在感染24小時(shí)后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，不經(jīng)嘌呤霉素篩選。我們對(duì)構(gòu)建成功的miR-146a過表達(dá)及抑制的NK-92細(xì)胞系進(jìn)行基本表型及功能的檢測(cè)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡，CFSE/7AAD法

8、檢測(cè)細(xì)胞NK-92細(xì)胞對(duì)HepG2細(xì)胞的殺傷能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面受體及殺傷相關(guān)分子perforin、IFN-γ、TNF-α等表達(dá)水平。
　　然后，在明確miR-146a的抑制作用后我們尋找誘導(dǎo)miR-146a表達(dá)的因素。我們用HepG2細(xì)胞及其培養(yǎng)上清、CHB及HCC患者外周血清、抑制性細(xì)胞因子IL-10/IL-6/TGF-β、活化性因子polyI∶C/IL-12/IL-15/IFN-α分別與NK細(xì)胞孵育，并用定量PCR檢

9、測(cè)NK細(xì)胞中miR-146a的表達(dá)。
　　在尋找NK細(xì)胞中miR-146a靶基因時(shí)，我們首先通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)新的靶基因，通過RIP實(shí)驗(yàn)和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行證實(shí);同時(shí)，對(duì)已經(jīng)報(bào)道的靶基因，通過western檢測(cè)這些基因在miR-146a過表達(dá)及抑制的NK-92細(xì)胞中的表達(dá)水平。確定了miR-146a的靶基因?yàn)镾TAT1后，用IFN-α和Fludarabine分別刺激和抑制STAT1的磷酸化，檢測(cè)STAT1通路活化或抑制后NK

10、細(xì)胞殺傷活性。CFSE/7AAD法檢測(cè)NK-92細(xì)胞對(duì)HepG2細(xì)胞的殺傷活性，LDH法檢測(cè)原代NK細(xì)胞對(duì)HepG2細(xì)胞的殺傷活性。
　　最后，分選CHB、HCC患者外周血NK細(xì)胞，體外加IL-12/IFN-α/IFN-β孵育細(xì)胞模擬臨床細(xì)胞因子治療CHB或HCC的過程，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞表面CD107a表達(dá)水平，定量PCR檢測(cè)細(xì)胞表面miR-146a的表達(dá)水平。
　　第二部分淋巴結(jié)定向注射HBsAg用于防治慢性HBV感

11、染的研究
　　首先我們通過尾靜脈高壓注射pAAV/HBV1.2質(zhì)粒的方法建立HBV持留小鼠模型，斷尾取血，ELISA方法檢測(cè)血清中HBsAg水平以確定HBV陽性小鼠。淋巴結(jié)內(nèi)注射HBsAg來治療HBV感染，共治療三次，每次間隔一周，并且自治療前一天開始每隔一周斷尾取血一次，收集血清。ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中HBsAg和HBeAg水平以觀測(cè)HBV清除的程度。淋巴結(jié)注射后取小鼠淋巴結(jié)，肉眼及HE染色觀察淋巴結(jié)組織狀況，以此判斷這種

12、注射方式是否對(duì)組織造成損傷。免疫組織化學(xué)分析小鼠肝組織中HBcAg的表達(dá)。進(jìn)一步提取小鼠肝臟、脾臟、淋巴結(jié)、外周血中淋巴細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分子標(biāo)志以確定各細(xì)胞亞群的變化。另外，淋巴細(xì)胞分離后在體外培養(yǎng)，加PMA和離子霉素刺激，加BFA抑制蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，然后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)分子表達(dá)。
　　研究結(jié)果：第一部分 miR-146a通過靶向STAT1負(fù)調(diào)NK功能。
　　1.人CHB和HCC患者外周血NK

13、細(xì)胞殺傷功能受到抑制
　　分選出CHB和HCC患者外周血NK細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的殺傷活性，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與健康志愿者相比，CHB和HCC患者NK細(xì)胞對(duì)HepG2細(xì)胞殺傷活性明顯降低。
　　2.CHB及HCC患者外周血NK細(xì)胞中miR-146a表達(dá)水平升高
　　分選出CHB和HCC患者外周血NK細(xì)胞，定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與健康志愿者相比，CHB和HCC患者外周血NK細(xì)胞中miR-146a表達(dá)水平升高，并且mi

14、R-146a表達(dá)水平與NK細(xì)胞的殺傷活性呈負(fù)相關(guān)。
　　3.miR-146a過表達(dá)/抑制的NK-92細(xì)胞系的建立
　　NK-92感染病毒后用嘌呤霉素成功篩選出miR-146a過表達(dá)及抑制的NK-92細(xì)胞系（NK92-146a-over、NK92-146a-inh和NK92-NC），檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-146a過表達(dá)細(xì)胞中miR-146a表達(dá)升高10倍。MiR-146a過表達(dá)慢病毒感染原代NK細(xì)胞24小時(shí)，檢測(cè)到細(xì)胞中miR-14

15、6a表達(dá)可升高約2.5倍。
　　4.miR-146a抑制NK細(xì)胞的功能
　　對(duì)NK92-146a-over及NK92-146a-inh細(xì)胞系的基本性質(zhì)和功能進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果miR-146a不影響NK細(xì)胞的增殖、周期、凋亡，不改變NKG2A/NKG2D/NKp30/NKp44/NKp80受體的表達(dá)，但是miR-146a能夠抑制NK細(xì)胞的殺傷活性，抑制其分泌細(xì)胞因子的能力。體外抑制CHB和HCC患者NK細(xì)胞中miR-146a，可以

16、恢復(fù)NK細(xì)胞殺傷功能。
　　5.細(xì)胞因子IL-10及TGF-β促進(jìn)NK細(xì)胞miR-146a的表達(dá)
　　將NK細(xì)胞與HepG2細(xì)胞共孵育后發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞中miR-146a表達(dá)明顯升高，當(dāng)NK細(xì)胞與HepG2以transwell非接觸形式共孵育時(shí)，NK細(xì)胞中miR-146a升高的程度降低，這說明HepG2表面分子及分泌的細(xì)胞因子都能促進(jìn)miR-146a的表達(dá)。
　　用CHB及HCC患者血清分別孵育NK細(xì)胞，細(xì)胞中miR-14

17、6a表達(dá)明顯升高，進(jìn)一步用細(xì)胞因子IL-10/IL-6/TGF-β孵育NK細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IL-10和TGF-β能夠誘導(dǎo)NK細(xì)胞miR-146a的表達(dá)。
　　6.NK細(xì)胞中miR-146a調(diào)控的靶分子的確定
　　在軟件預(yù)測(cè)及RIP實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)TRAIL可能是miR-146a的靶基因，但是熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)否定了該結(jié)果，實(shí)驗(yàn)證實(shí)TRAIL并不是miR-146a在NK細(xì)胞中的直接靶基因。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示STAT1

18、的表達(dá)在miR-146a過表達(dá)的NK-92細(xì)胞系中升高，在miR-146a抑制的NK-92細(xì)胞系中下降，提示NK細(xì)胞中STAT1是miR-146a的靶基因。
　　7.miR-146a通過靶向STAT1調(diào)控NK細(xì)胞的功能
　　STAT1活化后，NK殺傷活性增強(qiáng)，STAT1抑制后，NK細(xì)胞殺傷活性降低。并且在Fludarabine抑制STAT1后，miR-146a對(duì)NK-92細(xì)胞的抑制作用不明顯，說明miR-146a通過靶向ST

19、AT1調(diào)控NK細(xì)胞的功能。
　　8.在臨床應(yīng)用細(xì)胞因子治療CHB和HCC中可以通過影響miR-146a來改善NK細(xì)胞的功能
　　分選CHB和HCC患者外周血NK細(xì)胞，體外用IFN-α等細(xì)胞因子刺激模擬臨床用細(xì)胞因子治療CHB和HCC的過程，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子處理能顯著抑制miR-146a的表達(dá)水平并且NK細(xì)胞殺傷標(biāo)志CD107a表達(dá)升高，因此，對(duì)miR-146a表達(dá)進(jìn)行干擾能夠改善NK細(xì)胞的功能。
　　第二部分淋巴結(jié)定向注射

20、HBsAg用于防治慢性HBV感染的研究
　　1.HBV慢性感染小鼠模型的建立及免疫耐受狀態(tài)的檢測(cè)
　　成功建立HBV持留小鼠模型，對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，表達(dá)成熟分子CD80/CD86的DC比例下降，而表達(dá)抑制性分子PD-1的T細(xì)胞比例升高。
　　2.淋巴結(jié)注射對(duì)組織結(jié)構(gòu)的影響
　　肉眼觀察及HE染色均顯示，淋巴結(jié)注射生理鹽水不影響淋巴結(jié)的大小和結(jié)構(gòu)，說明淋巴結(jié)注射不會(huì)造成組織損傷。
　　3.淋巴結(jié)注射對(duì)

21、慢性HBV感染的治療效果優(yōu)于肌肉注射市售疫苗
　　淋巴結(jié)注射HBsAg能夠降低HBV小鼠外周血中HBsAg水平，而肌肉注射市售疫苗對(duì)慢性HBV感染沒有治療作用。
　　4.淋巴結(jié)注射HBsAg與注射NS相比有明顯的治療效果
　　與淋巴結(jié)注射生理鹽水相比，注射HBsAg能顯著降低外周血HBsAg水平，且能降低肝臟內(nèi)HBcAg的水平。
　　5.淋巴結(jié)注射HBsAg治療慢性乙肝的機(jī)制
　　淋巴結(jié)注射HBsAg明顯增

22、加小鼠淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞的數(shù)目，淋巴結(jié)中DC細(xì)胞數(shù)量明顯增加，且表達(dá)成熟分子CD80/CD86/CD40的DC比例增加;成熟DC誘導(dǎo)體內(nèi)記憶細(xì)胞增殖分化，產(chǎn)生出大量的HBV特異性的效應(yīng)性T細(xì)胞，發(fā)揮清除HBV的作用。
　　6.淋巴結(jié)注射HBsAg對(duì)HBV感染的預(yù)防作用
　　與肌肉注射相比，淋巴結(jié)注射HBsAg誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體較弱，但是依然能有效地抑制HBV的感染，并且能夠長期預(yù)防HBV的感染。進(jìn)一步的研究證實(shí)，淋巴結(jié)注射HBsA

23、g誘導(dǎo)體內(nèi)更多的中樞記憶性T細(xì)胞出現(xiàn)，在再次遇到HBV感染時(shí)這些記憶細(xì)胞分化為大量的效應(yīng)細(xì)胞達(dá)到清除HBV的目的。
　　結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者外周血NK細(xì)胞殺傷活性的降低與NK細(xì)胞中miR-146a的高表達(dá)有關(guān)。高表達(dá)的miR-146a通過靶向STAT1分子抑制了NK細(xì)胞的殺傷活性及分泌細(xì)胞因子的能力。而CHB患者血清中含有高水平的IL-10和TGF-β，這些免疫抑制因子可以誘導(dǎo)NK細(xì)胞中miR-146a的表達(dá)。在CHB以及

24、HCC治療中使用IFN-α/IL-12等激活性細(xì)胞因子，可以抑制NK細(xì)胞的miR-146a，或者使用特異性阻遏物封閉內(nèi)源性miR-146a都能夠有效恢復(fù)NK細(xì)胞抗感染和抗腫瘤能力。
　　淋巴結(jié)注射HBsAg能夠降低慢性HBV模型小鼠外周血中HBsAg及肝內(nèi)HBcAg的水平，對(duì)清除慢性HBV感染有顯著效果。機(jī)制研究證明，淋巴結(jié)注射HBsAg能夠募集大量的DC到淋巴結(jié)并促進(jìn)DC的成熟，大量成熟的DC細(xì)胞通過遞呈抗原誘導(dǎo)體內(nèi)記憶細(xì)胞分化

25、為更多的HBV特異性效應(yīng)T細(xì)胞，發(fā)揮清除病毒的作用。另外，進(jìn)一步的研究證實(shí)，淋巴結(jié)注射HBsAg能夠有效的預(yù)防HBV感染，并且預(yù)防作用不依賴于抗體的產(chǎn)生，而是依賴記憶性T細(xì)胞和效應(yīng)性T細(xì)胞的產(chǎn)生。
　　意義：免疫細(xì)胞處于耐受狀態(tài)，免疫系統(tǒng)功能低下是慢性乙型病毒性肝炎難以治愈的根本原因。本研究從固有免疫和獲得性免疫兩方面尋找慢性乙肝治療策略。一方面，我們發(fā)現(xiàn)慢性HBV感染中NK細(xì)胞功能的異常與miR-146a相關(guān)，探討了miR-14