抗HBs Fab-IFNα對HBV感染作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(haepatitis B virus，HBV)的感染會(huì)導(dǎo)致急慢性乙型肝炎的發(fā)生，是引起肝硬化、肝細(xì)胞癌的重要因素之一。盡管目前有核苷類藥物和干擾素等抗乙型肝炎病毒制劑，但缺乏切實(shí)有效的長期應(yīng)答效應(yīng)以及受個(gè)體耐藥等因素的制約，故慢性HBV感染的治療仍然是目前面臨的一道難題。 IFNα因其能抑制HBV-DNA的復(fù)制，常被用作治療病毒感染的抗病毒藥物。有研究報(bào)道，在慢性肝炎攜帶者中IFNα治療有效性僅為30％，其中約有5

2、0％的患者在停止治療后可出現(xiàn)復(fù)發(fā)。為了達(dá)到抗病毒效果，藥物劑量常要加大幾倍、幾十倍，藥物劑量的加大也加重了其不良反應(yīng)，又容易產(chǎn)生干擾素抗體，從而影響療效，限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。我們通過將抗乙肝表面抗原抗體Fab片段與IFNα在分子水平上進(jìn)行重組，并制備了重組的融合蛋白(anti-HBs Fab-IFNα)，以期通過抗體與干擾素的雙重作用，實(shí)現(xiàn)感染細(xì)胞水平上的抗病毒性肝炎的生物導(dǎo)向治療。 第一部分人源性抗HBs Fab和IFN

3、α融合蛋白的原核表達(dá) 基于前序制備的人源化抗HBs-Fab抗體具有免疫學(xué)活性，這部分實(shí)驗(yàn)的目的是構(gòu)建和表達(dá)人源性抗-HBs Fab和IFNα融合蛋白。以pBAD IFNα質(zhì)粒為模板，根據(jù)IFNα基因序列結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)引物，在引物5’和3’端加入XbaI的酶切位點(diǎn)和含有5個(gè)氨基酸的連接肽序列。依據(jù)：PCR產(chǎn)物兩端所引入的限制性內(nèi)切酶，以相同的酶分別酶切PCR產(chǎn)物和pBAD Fab載體，以T4連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10大腸桿菌后，

4、挑取單菌落增菌，經(jīng)測序和PCR鑒定，篩選陽性克隆。 挑取正確插入的轉(zhuǎn)化菌落，于100ml含Amp的LB培養(yǎng)基中生長，以阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)上清經(jīng)Ni-NTA柱純化、濃縮后，12％的SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，經(jīng)封閉后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG Fab反應(yīng)，于25Kd和47.5Kd處可見明顯蛋白區(qū)帶，推測47.5Kd的區(qū)帶為九和IFNα的融合蛋白，25Kd處為重鏈的Fd段。Western blot和HBs

5、Ag特異性Dot blot結(jié)果表明融合蛋白中的輕鏈具有較好的抗原結(jié)合活性，IFNα活性達(dá)4.2×103～4.85×104IU/ml。 第二部分人源性抗-HBsλ和IFNα融合蛋白的真核表達(dá) 巴斯德畢赤酵母具有真核表達(dá)系統(tǒng)的諸多優(yōu)點(diǎn)，可對表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的加工、折疊與修飾，從而使表達(dá)出的蛋白具有生物活性；與其他真核表達(dá)系統(tǒng)相比，既具有原核表達(dá)系統(tǒng)操作簡易、易于培養(yǎng)、生長速度快、表達(dá)量高、成本低等優(yōu)點(diǎn)：且能利用甲醇作為唯

6、一的碳源和能量來源。在P．pastoris中表達(dá)的蛋白既可存在于細(xì)胞內(nèi)，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于純化。 將目的片段克隆到pPICZαC載體的AOX1啟動(dòng)子基因后，分離純化質(zhì)粒DNA，PCR、測序鑒定。將重組質(zhì)粒以BstX I內(nèi)切酶線性化，經(jīng)電穿孔方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入X33菌株，在Zeocin濃度為100μg/ml的轉(zhuǎn)化平板上挑取轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行小規(guī)模培養(yǎng)。 培養(yǎng)上清中的λ-IFNα用BrCN-sepher

7、ose4B柱純化，純化后的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，表達(dá)蛋白的分子量約為50Kd，略大于其在原核中表達(dá)的分子量，用ELISA法檢測融合蛋白IFNα的抗原性及其抗體親和力，用WISH細(xì)胞檢測IFNα生物學(xué)活性，證實(shí)融合蛋白既具有與抗HBs Fab相近的HBsAg的親和力，又具有干擾素活性，干擾素活性達(dá)到7.8x104～5.1×105IU/ml，高于原核表達(dá)系統(tǒng)(p＜0.01)；Western blot和HBsAg特異性Dot blo

8、t結(jié)果也表明表達(dá)產(chǎn)物具有較好的抗原結(jié)合活性。 第三部分抗HBsλ-IFNα對HBV感染作用的實(shí)驗(yàn)研究 目前體外研究HBV感染是以HBV基因組轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞作為細(xì)胞模型，HepG2.2.15就是以HBV基因組轉(zhuǎn)染HepG2而建立的。HepG2.2.15呈現(xiàn)持續(xù)表達(dá)HBV，并被證明在其培養(yǎng)上清中可檢測到HBsAg，HBeAg和HBV DNA顆粒的釋放。HBVDNA含量為1.2×105～3.7×105拷貝/ml，HBsAg濃度為

9、16.2～20.5 COl(正常參考值為＜1.0 COI)，HBeAg濃度為230～320 Ncu/L(正常參考值為＜30 Ncu/L)。HepG2.2.15可以作為探索HBV病原體與宿主的相互作用的工具，是評估抗HBV新藥的良好模型。 用于研究的λ-IFNα是含有人抗HBsλ抗體片段與IFNα的融合蛋白。本實(shí)驗(yàn)旨在比較IFNα和λ-IFNα兩種不同的制劑對HepG2.2.15細(xì)胞的作用，檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中病毒釋放的HBV-DN

10、A和抗原含量。分別收集培養(yǎng)9天的HepG2.2.15細(xì)胞及上清，以ELISA法檢測HtBsAg和HBeAg的含量，以熒光定量PCR法檢測病毒載量，融合蛋白的細(xì)胞毒性用MTT法進(jìn)行檢測。 Fas是細(xì)胞表面重要的介導(dǎo)凋亡的受體，是細(xì)胞凋亡的信號(hào)分子。Fas與配體FasL結(jié)合，活化并傳導(dǎo)凋亡信號(hào)，是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要途徑，在機(jī)體的免疫監(jiān)視過程中起重要作用。凋亡抑制是腫瘤細(xì)胞的基本特征之一，因此腫瘤細(xì)胞抵抗Fas介導(dǎo)的凋亡，可能是腫瘤

11、細(xì)胞免疫逃逸的機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)通過對HepG2.2.15細(xì)胞系Fas的表達(dá)及功能進(jìn)行檢測，了解重組蛋白λ-INFα對肝癌細(xì)胞凋亡的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過9天的連續(xù)培養(yǎng)，λ-IFNα各個(gè)濃度組均能降低細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg、HBeAg及HBV-DNA的含量，且隨時(shí)間的延長和藥物濃度的增高，其作用也隨之增強(qiáng)(P＜0.05)，而λ-IFNα和IFNα組間的抑制作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。同時(shí)在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，λ-IFN

12、α最高濃度組對細(xì)胞的毒性與陽性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。2 IU/ml、10 IU/ml濃度的λ-IFNα對HBV-DNA、HBsAg和HBeAg的抑制率差異無顯著性(P＞0.05)，20 IU/ml、50 IU/ml、100 IU/ml濃度的λ-IFNα對HBV-DNA、HBsAg和HBeAg的抑制率有顯著差異(P＜0.05)，λ-IFNα對HBsAg、HBeAg和HBV-DNA的抑制率高于同濃度的IFNα(P＜0.05

13、)。提示通過抗體片段的運(yùn)載，使IFNα更易或更多的與靶細(xì)胞表面的IFNα受體結(jié)合，從而更有效發(fā)揮IFNα抗HBV效果。 HepG2.2.15細(xì)胞低表達(dá)Fas蛋白，經(jīng)λ-IFNα處理后Fas表達(dá)增加。HepG2.2.15能抵抗Fas介導(dǎo)的凋亡，F(xiàn)as激活抗體CH11不能誘導(dǎo)HepG2.2.15的凋亡。HepG2.2.15經(jīng)λ-IFNα僅處理后可上調(diào)Fas的表達(dá)，CH11能誘導(dǎo)其凋亡的發(fā)生(p＜0.05)。 越來越多的證據(jù)