HBV對實驗性狼瘡的保護作用及其機制.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematolsus，SLE）是一種彌漫性，全身性的自身免疫病，好發(fā)于青年女性，發(fā)病高峰為15-40歲，同齡男女發(fā)病比例約為1∶7到1∶10。SLE發(fā)病存在明顯的種族地區(qū)因素差異性，世界各地報道SLE的發(fā)病率約在10-100/10萬之間，我國的發(fā)病率約為70/10萬。SLE患者的主要特征是血清中出現(xiàn)多種針對自身組織成分的自身抗體，通過免疫復(fù)合物等途徑造成多種器官，多個系統(tǒng)的損害。其臨

2、床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，主要累及皮膚黏膜，骨骼肌肉，腎臟及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
　　 自身免疫病的發(fā)病受遺傳，環(huán)境，激素水平等因素的共同影響。既往研究發(fā)現(xiàn)，感染是誘發(fā)自身免疫病的最重要環(huán)境因素之一。自身免疫病的發(fā)生發(fā)展與感染有密切關(guān)系，各種病原體（細菌，病毒，寄生蟲和真菌）均可使具有潛在免疫失調(diào)的人誘發(fā)自身免疫病。同一種病原體可誘導(dǎo)產(chǎn)生多種自身免疫病，但是不同的病原體也可能誘發(fā)同一種自身免疫病。而最新的研究發(fā)現(xiàn)，部分感染性疾病對自身免疫病還存

3、在“保護”作用。但二者之間相互作用的具體機制尚未明確。
　　 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）屬于嗜肝DNA病毒科，是人類乙型肝炎的特異性病原體。據(jù)WHO估計，目前感染過HBV的人約有20億，慢性感染的的超過3.5億，其中75％發(fā)生在亞洲。我國是HBV感染的高發(fā)區(qū)，乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)攜帶率約占總?cè)丝诘?.18％，由此推算，全國約有9300萬

4、人攜帶乙肝病毒，其中乙肝患者超過3000萬。多項研究表明HBV感染與自身免疫病發(fā)病關(guān)系密切，其機制可能是通過分子模擬，旁觀者效應(yīng)，抗原表位擴增，刺激非免疫細胞表達主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）分子等刺激機體產(chǎn)生自身抗體和激活自身反應(yīng)性T淋巴細胞，從而導(dǎo)致自身免疫病的發(fā)生。因此理論上HBV可能促進SLE疾病的發(fā)生與發(fā)展。但最近的臨床研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者HBV感染率明顯低于正

5、常人，同時，SLE患者HBeAg的陽性率明顯低于對照人群，并且慢性乙肝合并SLE患者的腎臟損害程度、IFN-α、IFN-γ、抗ds-DNA抗體滴度和狼瘡指數(shù)均明顯低于非合并慢性乙肝SLE患者。提示HBV感染可能對SLE發(fā)生發(fā)展具有拮抗（保護）作用，但迄今缺乏HBV對SLE保護作用的實驗依據(jù)，其機制尚不清楚。
　　 本文通過Pristane誘導(dǎo)，建立HBV轉(zhuǎn)基因BALB/c小鼠和同基因型BALB/c小鼠實驗性狼瘡模型。通過實驗性狼

6、瘡鼠自身抗體水平、腎臟損傷，探討HBV對SLE發(fā)生的保護作用;用液相懸浮芯片技術(shù)，檢測狼瘡模型形成過程中相關(guān)細胞因子表達水平的變化，分析相關(guān)細胞因子水平和狼瘡病理改變的相關(guān)性，探討HBV抑制SLE病理進程的機制。通過上述研究探討HBV對SLE的保護作用及其機制，為該疾病的臨床治療及藥物靶點的選擇提供理論依據(jù)及指導(dǎo)。
　　 第一部分：HBV對實驗性狼瘡的保護作用
　　 目的：利用BALB/c小鼠與HBV轉(zhuǎn)基因鼠建立狼瘡模型

7、，并比較不同組間小鼠SLE的發(fā)病率及腎臟損傷程度。
　　 方法：21只雌性BALB/c-HBV轉(zhuǎn)基因小鼠及雌性同基因型BALB/c小鼠隨機分為SLE造模組和對照組。造模組一次性腹腔注射降植烷0.5mL，對照組注射生理鹽水0.5mL。四組小鼠分別為:一組，BALB/c-HBVTg-saline組;二組，BALB/c-HBVTg-Pristane;三組，BALB/c-saline;四組，BALB/c-Pristane組。注射前及注射

8、后每月一次剪尾取血50μL，分離血清置于-80℃待用。腹腔注射6個月后，采用摘眼球法處死小鼠，同時收集血液至Eppendorf管（EP管）中，分離血清-80℃保存待用。間接免疫熒光法檢測造模前小鼠尾靜脈血清和造模后6個月血清中ANA及抗ds-DNA抗體。小鼠處死后，取腎臟組織中性甲醛固定1周后，脫水石蠟包埋后制備組織切片。應(yīng)用HE染色及PAS染色后，顯微鏡下觀察比較不同組間腎臟損傷程度差別，同時計算腎小球細胞外基質(zhì)(ECM)堆積指數(shù)。各

9、組間ANA滴度的比較采用非參數(shù)檢驗。各組間抗ds-DNA抗體陽性率的比較采用x2檢驗fisher確切概率法。腎小球ECM堆積指數(shù)比較使用采用完全隨機設(shè)計的單因素方差分析方法(ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD檢驗，應(yīng)用SS18.0分析軟件，檢驗水準α=0.05。
　　 結(jié)果：(1)模型小鼠存活情況:BALB/c-HBVTg-saline組，存活9只，死亡2只;BALB/c-HBVTg-Pristane組，存活8只，死亡2只;B

10、ALB/c-saline組，存活11只，死亡0只;BALB/c-Pristane組，存活10只，死亡0只。(2)HBV轉(zhuǎn)基因狼瘡模型鼠的ANA水平明顯低于同基因型BALB/c狼瘡模型鼠:BALB/c-Pristane組造模前后ANA陽性率的比較有顯著性差異，P＜0.001，說明造模成功。而BALB/c-HBVTg-Pristane組，及兩組對照在造模前后陽性率變化均無統(tǒng)計學(xué)差異。造模后第6月時，BALB/c-HBVTg-Pristane

11、組ANA滴度顯著低于BALB/c-Pristane組，P=0.001。(3)HBV轉(zhuǎn)基因狼瘡模型鼠的抗ds-DNA抗體陽性率顯著低于同基因型BALB/c狼瘡模型鼠:BALB/c-Pristane組造模前后抗ds-DNA抗體陽性率的變化明顯，P=0.02。BALB/c-HBVTg-Pristane組造模前后抗ds-DNA抗體陽性率的變化無統(tǒng)計學(xué)差異，P=0.444，兩組對照組造模前后均無明顯變化。造模后第6月時，HBV轉(zhuǎn)基因狼瘡模型鼠抗d

12、s-DNA抗體陽性率明顯低于同基因型BALB/c狼瘡模型鼠，P=0.025。(4)腎小球病變:腎小球HE染色顯示，BALB/c及BALB/c-HBV對照組腎小球腎小球大致正常;BALB/c-Pristane組腎小球變小，系膜區(qū)增寬，系膜細胞和血管內(nèi)皮細胞明顯增多，炎細胞浸潤，腎小球毛細血管袢開放不良，包曼囊壁有增厚;HBV轉(zhuǎn)基因狼瘡模型鼠僅有輕度系膜增生，腎小球病變明顯較同基因型BALB/c狼瘡模型鼠輕。(5)基底膜/系膜糖原沉積:用P

13、AS染色檢測基底膜/系膜糖原沉積情況。HBV轉(zhuǎn)基因鼠和同基因型BALA/c鼠對照組均未見明顯糖原沉積。BALB/c-pristane（模型）組糖原沉積明顯增多，主要分布于腎小球基底膜及增生的系膜;BALB/c-HBVTg-pritane（HBV轉(zhuǎn)基因鼠模型組）組糖原沉積輕度增多;主要分布于腎小球基底膜。(6)HBV轉(zhuǎn)基因狼瘡模型鼠的ECM堆積指數(shù)顯著低于同基因型BALB/c狼瘡模型鼠:狼瘡模型鼠的ECM堆積指數(shù)均明顯高于其對照組;而HB

14、V轉(zhuǎn)基因狼瘡模型組顯著低于同基因型BALB/c鼠模型組，P＜0.001，即HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型組腎臟損傷較同基因型的BALB/c小鼠模型組輕。
　　 結(jié)論：1.建立了pristane誘導(dǎo)狼瘡鼠模型。2.HBV轉(zhuǎn)基因狼瘡模型鼠的自身抗體（ANA和抗ds-DNA抗體）水平明顯低于同基因型的BALB/c狼瘡模型鼠，前者的狼瘡腎炎樣的病理改變也明顯輕于后者。提示HBV對實驗性狼瘡具有保護作用。
　　 第二部分：HBV對實驗性狼瘡

15、保護作用的機制
　　 目的：研究SLE相關(guān)細胞因子變化，探討HBV與SLE相互作用的具體機制。
　　 方法：小鼠多通道細胞因子芯片檢測造模后第1個月和造模后第6個月時的。
　　 小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-12p70、IL-17、TNF-α六種細胞因子。ELISA法檢測造模后第2個月和造模后第6個月時的小鼠血清BAFF水平。各組之間細胞因子表達水平的比較使用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩

16、比較采用LSD檢驗。分析軟件為SPSS18.0，雙側(cè)P＜0.05認為具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)果：(1)HBV轉(zhuǎn)基因狼瘡模型鼠的IL-17水平低于同基因型BALB/c狼瘡模型鼠:BALB/c-Pristane組的IL-17水平在造模后第6個月時較造模后第1個月顯著升高，P＜0.001。其他各組的IL-17水平在造模后第6個月與造模后第1個月相比，差別無統(tǒng)計學(xué)差異。造模后第6個月，BALB/c-Pristane組與BALB/c-H

17、BVTg-Pristane組IL-17水平均比其相應(yīng)對照組顯著提高，（P＜0.001，P=0.014）。但HBV轉(zhuǎn)基因鼠造模后IL-17水平明顯低于普通BALB/c小鼠造模后水平(P=0.006)。(2)HBV轉(zhuǎn)基因狼瘡模型鼠的TNF-α水平顯著低于同基因型BALB/c狼瘡模型鼠:造模后第1個月，BALB/c-HBVTg-Pristane組TNF-α水平顯著高于BALB/c-HBVTg-saline組(P=0.045)。BALB/c-P

18、ristane組在造模后第6個月時血清TNF-α水平顯著高于造模后第1個月，P＜0.001。其他各組造模后第6個月與造模后第1個月相比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義。HBV轉(zhuǎn)基因鼠造模后TNF-α水平雖有顯著升高，但仍明顯低于普通BALB/c小鼠造模后水平(P＜0.001)。(3)HBV轉(zhuǎn)基因狼瘡模型鼠的BAFF水平顯著低于同基因型BALB/c狼瘡模型鼠:造模后第1個月，造模組BAFF水平均較對照組明顯升高。BALB/c-Pristane組BAFF

19、水平較BALB/c-HBV+SLE顯著升高，P=0.009。造模后第6個月BALB/c-Pristane組BAFF水平較BALB/c-HBV+SLE顯著升高，P=0.042，但升高程度不如造模后第2個月時顯著。(4)IL-6在狼瘡模型組中顯著升高，但BALB/c-HBVTg-saline組升高更為顯著;HBV轉(zhuǎn)基因鼠的IL-2、IL-12p70水平較普通BALB/c鼠高;IL-4水平在各組中差別不明顯。(5)IL-17與TNF-α(r=

20、0.647，P＜0.001)、IL-6(r=0.529，P＜0.001)、IL-4(r=0.296,P=0.009)和BAFF（r=0.360，P=0.001）有明顯的相關(guān)性，而與IL-2、IL-12無明顯相關(guān)性。(6)IL-6與TNF-α(r=0.685，P＜0.001)、IL-17(r=0.529,P＜0.001)、IL-12p70(r=0.515，P＜0.001)、IL-4(r=0.473，P＜0.001)有明顯的相關(guān)性。