木犀草對實驗性腦缺血大鼠的腦保護作用及機制研究.pdf

1、腦血管病是我國居民死亡的第一原因和成人殘疾的第一原因，以缺血性腦血管病最為常見，具有發(fā)病率高、病死率高、致殘率高、復發(fā)率高、恢復緩慢的特點。缺血后繼發(fā)性腦損傷是患者的病情加重和影響預后的重要原因。近年來，腦缺血后腦損傷的病理生理機制研究已取得了重大進步，然而，臨床治療效果卻非常有限。
　　腦梗死后的繼發(fā)性腦損傷常導致病情加重，主要包括氧化應激、炎癥反應、凋亡、細胞內鈣超載、細胞毒性作用、活性氧及自由基等，這幾種因素之間相互作用、相

2、互影響，構成復雜的調控網絡，形成惡性循環(huán)，造成一系列病理級聯(lián)反應，其中過度炎癥反應、氧化應激和凋亡存在于腦梗死后壞死和缺血區(qū)域，成為導致繼發(fā)損傷的主要原因。因此，抗氧化應激、減輕炎癥損傷、抑制凋亡成為治療腦梗死的主要途徑之一。
　　木犀草素(Luteolin)是一種天然黃酮類化合物，分子式為：C15H10O6，存在于多種植物中，因最初是從木犀草科(Resedaceae)木犀草屬草本植物木犀草(ResedaodorataL)的葉、莖

3、、枝中分離出而得名，具有多種藥理活性，如抗炎、抗氧化、抑制凋亡、抗過敏、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、增強免疫功能等多種生物學作用，其毒副作用低，具有良好的臨床應用潛力。
　　本研究選用雄性Sprague-Dawley大鼠，應用改良Longa線栓法建立大鼠右側大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。在大鼠永久性大腦中動脈阻塞所致的腦缺血模型上觀察腦缺血后TLR4，TLR5，P38M

4、APK，ERK1/2，claudin-5，Bcl-2和Bax的表達，大腦皮層梗塞灶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)與過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性及丙二醛(Malondiadehyde，MDA)的含量。確定缺血后與炎癥反應、氧化損傷及凋亡的關系，并選用黃酮類化合物木犀草素進行干預，評價干預前后梗死體積、腦含水量、神經功能缺損評分，以及木犀草素對TLR4，TLR5，P38MAPK，ERK1/2

5、，claudin-5，Bcl-2和Bax的表達信號通路的影響，研究木犀草素對缺血損傷后的腦保護作用機制進行初步探討，并檢測木犀草素對氧化應激標志物SOD，CAT活性和MDA含量的影響。本研究分三部分，現(xiàn)將各部分內容概述如下。
　　第一部分木犀草素對實驗性腦缺血大鼠的抗氧化作用及機制研究
　　目的：觀察實驗性大鼠腦缺血損傷后不同時間點梗死體積、腦含水量、神經功能缺損評分，claudin-5的表達變化以及SOD，CAT的活性和M

6、DA的含量。研究木犀草素對腦缺血大鼠的腦保護作用。探討木犀草素抗氧化作用的相關機制。
　　方法：選用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠為研究對象，應用改良Longa線栓法制備大鼠右側大腦中動脈梗塞模型(MCAO)。實驗1：觀察木犀草素的神經保護作用，梗塞后24 h和72 h分別觀察神經功能缺損評分，腦含水量，梗塞體積。實驗動物隨機分為6組，假手術組(Sham)，假手術后腹腔注射等量生理鹽水+1%DMSO；手術組(MCAO

7、)，缺血術后腹腔注射等量生理鹽水；溶劑對照組(MC+DM)，缺血術后腹腔注射等量生理鹽水+1%DMSO；木犀草素小劑量組(Luteolin-L)，缺血術后腹腔注射木犀草素5 mg/kg；木犀草素中劑量組(Luteolin-M)，缺血術后腹腔注射木犀草素10 mg/kg；木犀草素大劑量組(Luteolin-H)，缺血術后腹腔注射木犀草素25 mg/kg。實驗2：觀察木犀草素的抗氧化功能。檢測腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化氫酶(C

8、AT)的活性，丙二醛(MDA)含量的變化情況。實驗動物隨機分為5組，假手術組(Sham)，手術組(MCAO)，溶劑對照組(MC+DM)，木犀草素中劑量組(Luteolin-M)，木犀草素大劑量組(Luteolin-H)。實驗3：觀察腦缺血后木犀草素對血腦屏障的影響。實驗動物隨機分為5組，假手術組(Sham)，手術組(MCAO)，溶劑對照組(MC+DM)，木犀草素中劑量組(Luteolin-M)，木犀草素大劑量組(Luteolin-H)。

9、各組取材前進行神經功能評分，干濕重法測定腦組織含水量，TTC染色評價腦梗死體積，分別用RT-qPCR的方法和Westernblot的方法檢測缺血腦組織claudin-5 mRNA和蛋白水平的變化。
　　結果：
　　1 Sham組無神經功能缺損，神經功能缺損評分為0分；MCAO組和MC+DM組在24 h和72 h神經功能缺損評分均較嚴重，Luteolin-L組在24 h和72 h與MCAO組和MC+DM組相比沒有明顯降低神經功

10、能缺損，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，Luteolin-M組和Luteolin-H組在24 h和72 h與MCAO組和MC+DM組相比均可明顯降低神經功能缺損，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　2 Luteolin-L組在24 h和72 h與MCAO組和MC+DM組相比均沒有明顯降低腦含水量，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，Luteolin-M組和Luteolin-H組在24 h和72 h與MCAO組和MC+DM組相比

11、均可明顯降低腦含水量，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　3 Luteolin-L組在24 h和72 h與MCAO組和MC+DM組相比均沒有明顯降低腦梗死體積，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，Luteolin-M組和Luteolin-H組在24 h和72 h與MCAO組和MC+DM組相比均可明顯降低腦梗死體積，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。我們可以看到木犀草素在每天10 mg/kg(Luteolin-M)和25 mg/k

12、g(Luteolin-H)時發(fā)揮更好的治療作用，因此，下面的研究集中在10 mg/kg和25 mg/kg。
　　4 Western blot中，與MCAO組和MC+DM組比較，Luteolin-H組在24 h和72 h均可明顯增加claudin-5的蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Luteolin-M組只在72 h可明顯增加claudin-5的蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　與Western b

13、lot的結果一致，Luteolin-H組在24 h和72 h與MCAO組和MC+DM組相比均可明顯增加claudin-5的mRNA表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Luteolin-M組只在72 h可明顯增加claudin-5的mRNA表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　5與MCAO組和MC+DM組比較，Luteolin-M組和Luteolin-H組在24 h和72 h均可明顯增加SOD，CAT的活性，差異有統(tǒng)計學

14、意義(P<0.05)。與MCAO組和MC+DM組比較，Luteolin-M組和Luteolin-H組在24 h和72 h均可明顯減低MDA的含量，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　結論：木犀草素對局灶性腦缺血大鼠有較好的神經保護作用，可改善腦缺血損傷后的神經功能缺失，減輕腦含水量，減小腦梗死體積，誘導claudin-5的表達，增加SOD，CAT的活性，減少MDA的含量，因此我們推測木犀草素的神經保護作用可能是通過增加clau

15、din-5的表達，提高SOD，CAT的活性，減少MDA含量實現(xiàn)的；這些是木犀草素發(fā)揮其抗氧化作用之一，從而實現(xiàn)其神經保護作用。
　　第二部分木犀草素對實驗性腦缺血大鼠的抗炎作用及機制研究
　　目的：觀察腦缺血后不同時間點TLRs/MAPKs/NF-κB的表達變化，研究木犀草素對腦缺血大鼠的抗炎作用，探討木犀草素抗炎作用的相關信號機制。
　　方法：選用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠為研究對象，應用改良Lon

16、ga線栓法制備大鼠右側大腦中動脈梗塞模型(MCAO)。實驗動物隨機分為5組，假手術組(Sham)，假手術后腹腔注射等量生理鹽水+1%DMSO；手術組(MCAO)，缺血術后腹腔注射等量生理鹽水；溶劑對照組(MC+DM)，缺血術后腹腔注射等量生理鹽水+1%DMSO；木犀草素中劑量組(Luteolin-M)，缺血術后腹腔注射木犀草素10 mg/kg；木犀草素大劑量組(Luteolin-H)，缺血術后腹腔注射木犀草素25 mg/kg。各組取材前

17、進行神經功能評分，分別用免疫組化，Western-blot和RT-qPCR的方法檢測缺血腦組織中TLR4、TLR5、p-p38，p-ERK，NF-κB蛋白和mRNA水平的變化。
　　結果：
　　1缺血后24 h和72 h，TLR4、TLR5、p-p38、NF-κB的表達均有升高，而p-ERK的表達在24 h時呈逐漸升高趨勢，72 h后逐漸降低。兩種劑量木犀草素干預后均可以降低腦缺血大鼠的炎癥表達。免疫組化中，與MCAO組和M

18、C+DM組相比，Luteolin-H組在24 h和72 h均可明顯降低TLR4、TLR5、p-p38、NF-κB的細胞數(shù)，增加p-ERK的細胞數(shù)。差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Luteolin-M組只在72 h與MCAO組和MC+DM組相比可明顯降低TLR4、TLR5、p-p38、NF-κB的細胞數(shù)，增加p-ERK的細胞數(shù)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　2 Western blot中，Luteolin-H組在24 h

19、和72 h與MCAO組和MC+DM組相比均可明顯降低TLR4、TLR5、p-p38、NF-κB的蛋白表達，增加p-ERK的蛋白表達。差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Luteolin-M組只在72 h與MCAO組和MC+DM組相比可明顯降低TLR4、TLR5、p-p38、NF-κB的蛋白表達，增加p-ERK的蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　3與免疫組化和Western blot的結果一致，Luteolin-H組在

20、24 h和72h與MCAO組和MC+DM組相比均可明顯降低TLR4、TLR5、p-p38、NF-κB的mRNA表達，增加p-ERK的mRNA表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Luteolin-M組只在72 h與MCAO組和MC+DM組相比可明顯降低TLR4、TLR5、p-p38、NF-κB的mRNA表達，增加p-ERK的mRNA表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　結論：局灶性腦缺血后，缺血腦組織的TLR4、TLR5

21、、p-p38、p-ERK、NF-κB表達的變化過程與腦組織損傷程度一致，提示TLR4/NF-κB通路的炎癥損傷參與了腦缺血損傷；木犀草素可下調TLR4、TLR5、p-p38、抑制NF-κB的核轉位，上調p-ERK，從而減輕缺血腦組織的過度炎癥反應，實現(xiàn)缺血后的神經保護作用。
　　第三部分木犀草素對實驗性腦缺血大鼠的抗凋亡作用及機制研究
　　目的：觀察腦缺血損傷后不同時間點Bcl-2/Bax的表達變化，研究木犀草素對腦缺血大鼠

22、的抗凋亡作用，探討木犀草素抗凋亡作用的相關信號轉導機制。
　　方法：選用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠為研究對象，應用改良Longa線栓法制備大鼠右側大腦中動脈梗塞模型(MCAO)。實驗動物隨機分為5組，假手術組(Sham)，假手術后腹腔注射等量生理鹽水+1%DMSO；手術組(MCAO)，缺血術后腹腔注射等量生理鹽水；溶劑對照組(MC+DM)，缺血術后腹腔注射等量生理鹽水+1%DMSO；木犀草素中劑量組(Luteol

23、in-M)，缺血術后腹腔注射木犀草素10 mg/kg；木犀草素大劑量組(Luteolin-H)，缺血術后腹腔注射木犀草素25 mg/kg。各組取材前進行神經功能評分，分別用免疫組化，Western-blot和RT-qPCR的方法檢測缺血腦組織中Bcl-2和Bax蛋白和mRNA水平的變化。
　　結果：
　　1缺血后24 h和72 h，Bcl-2的表達降低，Bax表達升高，免疫組化中，Luteolin-H組在24 h和72 h與

24、MCAO組和MC+DM組相比均可明顯增高Bcl-2的細胞數(shù)，降低Bax的細胞數(shù)。差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Luteolin-M組只在72 h與MCAO組和MC+DM組相比可明顯增高Bcl-2的細胞數(shù)，降低Bax的細胞數(shù)。差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　2 Western blot中，Luteolin-H組在24 h和72 h與MCAO組和MC+DM組相比均可明顯增加Bcl-2的蛋白表達，降低Bax的蛋白表達。差異有

25、統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Luteolin-M組只在72 h與MCAO組和MC+DM組相比可明顯增加Bcl-2的蛋白表達，降低Bax的蛋白表達。差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　3與免疫組化和Western blot的結果一致，Luteolin-H組在24 h和72h與MCAO組和MC+DM組相比均可明顯增加Bcl-2的mRNA表達水平，降低Bax的mRNA表達水平。差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Luteolin-M組