實驗性大鼠腦缺血后腦紅蛋白的動態(tài)表達及保護機制研究.pdf

1、目的：腦血管病是臨床常見病和多發(fā)病，以其高發(fā)病率、高致殘率和高病死率，嚴重影響著患者的預期壽命和生活質量，其中缺血性腦血管病占全部腦血管病的70％。腦梗死損傷的機制十分復雜，缺乏有效的干預手段。目前認為參與腦梗死損傷的病理生理機制與細胞內(nèi)鈣超載、細胞凋亡、興奮性氨基酸的興奮毒性、氧自由基產(chǎn)生過多所致的氧化應激等因素有關。出血性腦梗死(hemorrhagic infarction,HI)又稱腦梗死后出血性轉變(hemon-hagic tr

2、ansformarion,HT)是急性缺血性腦卒中的常見并發(fā)癥。近年來由于抗凝與溶栓治療的廣泛應用，CT等影像學檢查的普及，關于HI的報道逐漸增多，但確切病理生理機制尚不清楚，亦無確定有效的治療方法。腦紅蛋白(neuroglobin，Ngb)是2000年由Burmester等德國科學家首先發(fā)現(xiàn)的一種新的攜氧球蛋白，廣泛表達于神經(jīng)組織，在神經(jīng)系統(tǒng)氧的攝取、運輸和利用等生理過程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)缺氧、缺血條件下Ngb表達升高，并且對神經(jīng)

3、系統(tǒng)缺氧、缺血損傷具有重要的神經(jīng)保護功能。Ngb在mRNA和蛋白水平均可被氯化血紅素(Hemin)所誘導，并呈時間和濃度依賴性。免疫共沉淀實驗證明Na+，K+-ATP酶β2亞基與Ngb以復合物的形式存在，推測Ngb有可能通過對Na+，K+-ATP酶所具有的離子環(huán)境內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調節(jié)功能發(fā)揮神經(jīng)元保護作用。本研究擬通過觀察大鼠腦梗死模型、出血性腦梗死模型中Ngb的動態(tài)表達及Hemin對其表達的影響，探討Ngb對腦保護的可能機制，以期為臨床采用N

4、gb刺激物治療缺血缺氧性疾病提供理論根據(jù)。方法：200只SD大鼠隨機分為4組，即大腦中動脈閉塞(middle cerebral arlery occlusion，MCAO)模型組，出血性腦梗死(hemorrhagic infarction, HI)模型組，Hemin干預組和假手術對照組。缺血模型組在模型建立成功后3-、6-、12-和24 h4個時間點隨機分為4個亞組。參照Longa等的線栓法制作大鼠MCAO模型；采用本實驗室的方法制備H

5、I模型；假手術對照組不插線，不注血。在相應時間點對大鼠進行行為學評分后過量麻醉斷頭處死，取出完整的腦組織，分別行蘇木精-伊紅染色和免疫組織化學染色檢測、TTC染色測定腦梗死體積、干-濕重法測定腦組織含水量、無機磷法測定Na+,K+-ATP酶活性、RT-PCR測定Ngb、Na+，K+-ATP酶α1亞基、α3亞基mRNA表達。 結果：1 腦組織含水量測定：MCAO組腦組織含水量于12 h開始升高(82.72±1.02)％，24 h顯

6、著升高(85.36±1.23)％。HI組水腫在12 h時即顯著升高(85.28±0.64)％，較假手術組有顯著性差異，并持續(xù)到24 h(85.19±0.96)％(P＜0.01)。Hemin干預組腦組織含水量12 h(81.27±1.25)％開始升高，至24 h含水量較MCAO組(85.36±1.23)％和HI組(85.19±0.96)％差異均有顯著性(P＜0.011。 2.腦梗死體積測定：缺血6 h時梗死體積明顯增大，至24 h

7、梗死體積達到最大。與MCAO組和HI組比較，Hemin處理組在缺血6 h后腦梗死體積差異均有顯著性(P＜0.01)，MCAO組和HI組之間比較，梗死體積無明顯變化。 3.Na+,K+-ATP酶活性測定：HI組Na+，K+-ATP酶活性自3 h(2.809±0.346)U/mgprot開始較MCAO組(4.565±0.776)U/mgprot、Heroin干預組(5.539±1.366)U/mgprot和1段手術組(5.612±0

8、.615)U/mgprot差異均有顯著性(P＜0.01)。缺血24 h Hemin干預組(4.793±1.310)U/mgprot較MCAO組(3.002±0.442)U/mgprot和HI組(2.162±0.101)U/mgprot差異均有顯著性(P＜0.05)，與假手術組比較無明顯差異。 4 腦組織切片HE染色觀察：假手術組及各缺血模型組早期腦組織很少炎細胞浸潤。腦梗死后6 h神經(jīng)元細胞水腫，病變周圍少量炎細胞浸潤，12 h

9、梗死周圍及炎細胞浸潤開始增多，24 h可以見到大量以中性粒細胞為主的炎性細胞。HI組可見梗死中心區(qū)血腫，大量的含鐵血黃素使細胞呈黃色或棕色，腦組織水腫、壞死，可見炎細胞浸潤。Hemin處理組顯示輕度缺血水腫改變，缺血范圍減小，染色無明顯變淡。 5 腦組織Ngb免疫組織化學結果：MCAO組、HI組缺血區(qū)Ngb陽性神經(jīng)元數(shù)量較Hemin處理組對應區(qū)域減少。m組早期Ngb陽性細胞數(shù)較MCAO組有一過性升高。隨著缺血時間的延長，正常形態(tài)

10、結構的陽性細胞數(shù)減少，至缺血24 h，Ngb陽性細胞幾乎無表達。 6 Ngb mRNA、Na+，K+-ATP酶α1亞基、α3亞基表達：缺血6 h后Ngb mRNA的表達在各組之間比較差異均有顯著性(P＜0.01)。6 h時MCAO組Ngb mRNA的表達(0.294±0.031)較其他各組差異均有顯著性(P＜0.01)。Hemin干預組的表達變化不明顯，至24 h仍顯著高于MCAO組(0.396±0.032)(P＜0.01、)。

11、HI組在6 h短暫升高(0.518±0.034)N降低(0.439±0.114)，但與MCAO組比較差異仍有顯著性(P＜0.01)。 Na+，K+-ATP酶α1亞基的表達在缺血模型組中無顯著性變化，但較假手術組差異均有顯著性(P＜0.01)；僅在缺血12h時，HI組(0.708±0.009)α1亞基mRNA表達顯著升高，與MCAO組和Hemin干預組比較差異有顯著性(P＜0.01)。α3亞基mRNA在缺血6 h時MCAO組的表達

12、(0.774±0.136)顯著高于Hemin干預組(0.537±0.071)(P＜0.05)，12 h時(0.440±0.072)較Hemin干預組(0.624±0.103)顯著減少(P＜0.05)，至24 h兩組之間無顯著差異，但較假手術組差異均有顯著性(P＜0.05)。HI組較MCAO組和Hemin干預組間差異無顯著性。結論：1 Hemin干預后Ngb在mRNA和蛋白水平表達增加。 2.Hemin干預組腦水腫減輕，腦梗死體積

13、減小，Na+，K+-ATP酶活性升高，可能與Ngb表達增多有關。 3.Na+，K+-ATP酶α3亞基mRNA的表達與Na+，K+-ATP酶活性變化趨勢相似，可能由于α3亞基對缺血更為敏感，Na+，K+-ATP酶主要通過α3亞基的變化調節(jié)來其活性。 4 HI組也可見Ngb表達增多，卻表現(xiàn)腦水腫加重，Na+，K+-ATP酶活性減低，可能是由于血腫中血紅蛋白分解產(chǎn)物高鐵血紅素刺激Ngb表達的同時，血腫釋放的炎癥因子等其他化學物