新工藝通心絡對實驗性腦缺血保護作用及機制研究.pdf

1、腦血管疾病是嚴重危害人類健康的疾病，是人類致殘和死亡的重要原因之一，其中以缺血性腦血管病最為多見。目前溶栓治療和神經保護治療是缺血性腦血管病的兩大干預策略。溶栓治療受到嚴格的時間窗限制，同時可帶來腦出血的副作用。神經保護研究雖越來越受到重視，但迄今仍沒有公認的具有顯著臨床療效的神經保護劑。通心絡膠囊是根據中醫(yī)絡病理論研制而成的中藥復方制劑。大量基礎和臨床研究證實，通心絡膠囊可以從多個病理環(huán)節(jié)減輕腦缺血性損傷。新工藝通心絡(nTXL)在原

2、有組方基礎上，采用蟲藥提取工藝對原有制劑進行了改良，本研究在考察其對實驗性腦缺血的保護作用基礎上，對其作用機制進行了初步探討。 目的：采用三氯化鐵局灶性腦缺血模型、線栓法大腦中動脈梗塞模型、動靜脈旁路血栓模型以及正常大鼠血小板聚集實驗，觀察新工藝通心絡(nTXL)對實驗性腦缺血大鼠腦梗塞面積、腦含水量、缺血區(qū)VEGF/BDNF表達的影響及抗血栓和抑制血小板聚集作用，探討該制劑對缺血后腦組織的保護作用及可能的作用機制，為其開發(fā)與應

3、用提供實驗與理論依據。 方法： 本研究分為以下三個部分： 1．新工藝通心絡對三氯化鐵致大鼠局灶性腦缺血后腦組織損傷的保護作用：清潔級健康Wistar大鼠，雌雄各半，隨機分為五組：假手術組、模型組、新工藝通心絡高劑量(2.24g/kg·d)、低劑量(1.12g/kg·d)、尼莫地平組。灌胃10天后，制備三氯化鐵局灶性腦缺血模型，造模后24小時，處死動物取腦。用TTC染色法測定梗塞面積，用干濕重法測定腦含水量，HE染

4、色觀察神經細胞組織形態(tài)學改變。 2．新工藝通心絡對線栓法致局灶性腦缺血大鼠缺血區(qū)VEGF、BDNF表達的影響： 雄性清潔級健康SD大鼠，隨機分為五組：假手術組、模型組、新工藝通心絡高劑量(2.24g/kg·d)、低劑量(1.12g/kg·d)、尼莫地平組。采用線栓法制備大鼠大腦中動脈梗塞(MCAO)局灶性腦缺血模型。以逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法及免疫組化法分別檢測腦缺血后3h、24h、72h、7d缺血區(qū)VEG

5、F、BDNF mRNA和蛋白表達的變化。 3．新工藝通心絡對實驗性血栓形成及血小板聚集的影響： 清潔級健康Wistar大鼠，雌雄各半，隨機分為以下五組：模型組、新工藝通心絡高劑量(2.24g/kgod)、中劑量(1.12g/kg·d)、低劑量(0.56g/kg.d)、阿斯匹林組。給藥十天后，采用動靜脈旁路血栓形成模型觀察新工藝通心絡對實驗性血栓的影響；采用比濁法，以ADP、膠原作為誘導劑考察了新工藝通心絡對大鼠血小板聚集

6、的影響。 結果： 第一部分： 對三氯化鐵所致大鼠局灶性腦缺血腦梗塞面積的影響：模型組梗塞區(qū)占半腦、全腦的重量百分比分別為：9.20±3.55％、4.61±1.78％：新工藝通心絡低劑量組梗塞區(qū)占半腦、全腦的重量百分比分別為：6.14±2.18％、3.08±1.08％(P<0.05)；新工藝通心絡高劑量組梗塞區(qū)占半腦、全腦的重量百分比分別為：5.14±2.75％、2.59±1.37％(P<0.01)。結果顯示：新工

7、藝通心絡能夠顯著抑制局灶性腦缺血的梗塞面積。 對三氯化鐵所致大鼠局灶性腦缺血腦含水量的影響：與假手術組相比，模型組患側半球含水量明顯增加(80.85±0.45vs 79.72±0.41，P<0.01)。與模型組相比，nTXL高劑量組能夠顯著抑制腦含水量(80.09±0.97 vs 80.85±0.45，P<0.05)，結果顯示：新工藝通心絡對局灶性腦缺血大鼠腦水腫有顯著抑制作用。 對三氯化鐵所致局灶性腦缺血大鼠組織形態(tài)學

8、的影響： 模型組大鼠缺血區(qū)皮層細胞周圍間隙增寬，血管周圍神經細胞大小不一，毛細血管萎縮，神經細胞腫脹，排列紊亂，分布不均，細胞核深染固縮，部分胞質自溶，部分顆粒脫失，周邊出現較大空暈，大鼠腦組織形態(tài)改變嚴重。新工藝通心絡高、低劑量治療組大鼠能夠使上述缺血性損傷明顯減輕，其中以高劑量組為優(yōu)。 第二部分： 對線栓法所致局灶性腦缺血大鼠缺血區(qū)BDNF mRNA的影響： BDNF時程變化：本實驗中，大腦局灶性腦缺

9、血后3h表達略有上升，而24h表達下降，3d后又開始上升，至缺血后7天達峰。新工藝通心絡對BDNF mRNA水平的影響：新工藝通心絡高劑量組在缺血后3h、24h、7d BDNF mRNA的表達水平均顯著高于模型組(P<0.01，P<0.05)，缺血后3d與模型組相比雖有一定的升高趨勢，但無統計學意義。低劑組在缺血后3h、24h BDNF mRNA的表達與模型組相比，有明顯升高(P<0.01，P<0.05)。 對線栓法所致的局灶性

10、腦缺血大鼠缺血區(qū)VEGF mRNA的影響： VEGF時程變化：在正常腦組織中VEGF mRNA表達很少，缺血后3h、24h、3d，VEGF mRNA表達逐漸增加，3d達高峰，缺血7d后又降至約正常水平。 新工藝通心絡對VEGF mRNA水平的影響：與模型組相比，新工藝通心絡高劑組(2.24g/kg)在缺血后3h、24hVEGFmRNA的表達水平均高于腦缺血模型組，但由于組內差異較大，未有統計學差異；在缺血后3d、7d，新

11、工藝通心絡高劑組VEGF mRNA表達顯著增強(P<0.01，P<0.05)?？梢姼邉┙M能延長VEGF mRNA的表達時相，在缺血后第七天仍有大量表達。新工藝通心絡低劑量組(1.12g/kg)與模型組相比，無明顯差異。 對線栓法所致的局灶性腦缺血大鼠缺血區(qū)VEGF、BDNF蛋白的影響： 免疫組化染色顯示：在腦組織缺血區(qū)，BDNF主要在神經元陽性表達，表達趨勢與mRNA基本吻合：缺血后3h表達略有上升，而24h表達下降，3

12、d后又開始上升，至缺血后7天達峰。在缺血后各時間點，新工藝通心絡高、低劑量組BDNF的表達均強于模型組，其中以高劑量組為優(yōu)。免疫組化染色顯示：VEGF在腦組織缺血區(qū)神經元、血管內皮細胞、神經膠質細胞均有陽性表達。在缺血后3h～3d間，VEGF表達逐漸加強，缺血后7天表達變弱。在缺血后各時間點，新工藝通心絡高、低劑量組VEGF的表達均強于模型組，其中以高劑量組為優(yōu)。 第三部分： 對實驗性血栓形成的影響： 對照組血栓

13、的濕重和干重分別為59.81±17.84和10.32±3.08；新工藝通心絡中劑量組(1.12g/kg)的血栓的濕重和干重分別為31.28±9.56和5.84±2.00(P<0.01)，抑制率達47.7％和43.4％；低劑量組(0.56g/kg)組的血栓的濕重和干重分別為43.21±5.79(P<0.05)和7.73±1.76(P<0.05)，抑制率達27.8％和24.5％；高劑量組(2.24g/kg)的血栓濕重和干重分別為54.73±

14、14.96和10.15±3.13，與模型組相比無顯著性差異。 對血小板聚集的影響：新工藝通心絡2.24g/kg、1.12g/kg、0.56g/kg對ADP誘導的血小板聚集的抑制率分別為：27.9％、42.8％、38.8％；對膠原誘導的血小板聚集的抑制率分別為：20.8％、28.0％、26.0％。除高劑組對膠原誘導的血小板聚集反應外，其它組與正常組血小板最大聚集率相比，均有顯著性降低作用(p<0.01或p<0.05)。 結