人鼠嵌合肝動物模型及其感染HBV的初步研究.pdf

1、肝臟是最早進行細胞移植實驗的器官之一.人肝細胞移植是當前醫(yī)學(xué)研究的重點領(lǐng)域,它不但可作為有效的治療手段,而且利用人肝細胞異種移植建立動物模型對于研究病毒感染性肝病大有裨益.異種肝細胞移植到具有免疫活性的嚙齒動物體內(nèi)會因宿主免疫系統(tǒng)的T淋巴細胞激活和遲發(fā)性超敏反應(yīng)而排斥供體細胞.要克服異種移植引發(fā)的排斥反應(yīng)可選用無免疫活性的小鼠作為受者,或是誘導(dǎo)產(chǎn)生針對移植物的特異耐受.免疫系統(tǒng)具有重要的識別功能,即識別自己和異己.對自身組織細胞產(chǎn)生耐受

2、,而對非己組織細胞識別后,引起有效的免疫應(yīng)答,通過排斥反應(yīng),從體內(nèi)消除異己物質(zhì).實驗證明,動物在胚胎發(fā)育時期接觸到外來抗原會逐漸對這些抗原產(chǎn)生免疫耐受,出生后允許異種移植物在體內(nèi)存活.該課題采用誘導(dǎo)胎鼠出生前對人胎肝細胞產(chǎn)生免疫耐受,出生后移植人胎肝細胞的方法,建立人鼠嵌合肝動物模型.而后接種乙型肝炎病毒(HBV)感染人血清,觀察嵌合在具有正常免疫活性大鼠肝內(nèi)的人肝細胞是否能感染HBV.實驗方法和結(jié)果如下:一、人鼠嵌合肝動物模型的初步建

3、立.妊娠14~18日Wistar大白鼠.在無菌操作下,暴露孕鼠子宮,對胎鼠腹腔內(nèi)注射人胎肝細胞.逐層縫合,讓孕鼠自然生產(chǎn).胎鼠出生后24小時內(nèi)于新生小鼠脾內(nèi)注射人胎肝細胞.采用免疫印跡法(Western blot)、逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)及免疫組織化學(xué)等方法,于不同時相檢測實驗大鼠血清人白蛋白、肝組織中人白蛋白mRNA及人肝細胞型細胞角蛋白CK18.結(jié)果于4、6、8周齡大鼠血清中

4、測出人白蛋白;4、6、8、10周齡大鼠肝組織中測出人白蛋白mRNA;4、6、8、10、12周齡大鼠肝組織中有CK18表達.上述結(jié)果表明經(jīng)過胚胎期人胎肝細胞誘導(dǎo)對其產(chǎn)生免疫耐受的胎鼠,出生后24小時內(nèi)接受人胎肝細胞移植,不需要免疫抑制劑而能夠在大鼠肝中存活.移植了人胎肝細胞的嵌合鼠能表達人白蛋白,說明移植的人胎肝細胞不僅在嵌合鼠肝內(nèi)存活,而且能夠保持一定的功能,維持近12周.二、人鼠嵌合肝感染HBV的探索.胚胎期人胎肝細胞誘導(dǎo)對其產(chǎn)生免疫

5、耐受的胎鼠,出生后24小時內(nèi)接受人胎肝細胞移植,1周齡時于大鼠腹腔內(nèi)注射肝功能正常的慢性HBV攜帶者血清.血清病毒學(xué)標志為HBV表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)及核心抗體(抗-HBc)均陽性,HBV DNA定量為7.154E+07.采用自動生化分析儀、血清酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、PCR及肝組織蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染

6、色、免疫組織化學(xué)等方法,于不同時相檢測實驗大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、HBsAg、HBV DNA,以及肝組織病理變化和HBsAg.結(jié)果大鼠血清HBsAg陽性率于4、6、8、10、12周齡時分別為61.9﹪、52.3﹪、38.1﹪、30.9﹪、16.7﹪.接種HBV后4~12周齡所有實驗大鼠ALT均出現(xiàn)了不同程度的增高,其中感染HBV者(稱感染組)ALT值不同時相點明顯高于未感染者(稱未感染組),整體趨勢為隨著感染時間推移呈先升高

7、后逐漸下降的過程,在8周齡時出現(xiàn)峰值.血清HBV DNA只在HBV感染組4、6、8、10周齡大鼠中檢出,其檢出率分別為69.2﹪、59.1﹪、68.8﹪、46.2﹪.病理觀察顯示,接種HBV后4~12周齡感染組和未感染組均有部分實驗大鼠肝組織出現(xiàn)細胞濁腫、變性,匯管區(qū)炎性細胞浸潤,但HBV感染組病理改變的檢出率在各時相點明顯高于未感染組.肝組織HBsAg陽性細胞只在HBV感染組4、6、8、10周齡大鼠中發(fā)現(xiàn).統(tǒng)計分析顯示肝組織病理改變檢

8、出率與ALT均值、血清HBV DNA及肝組織HBsAg檢出率之間具有相關(guān)性.結(jié)論:1.采用誘導(dǎo)胎鼠出生前對人胎肝細胞產(chǎn)生免疫耐受,出生后移植人胎肝細胞的方法,使移植到具有正常免疫活性大鼠體內(nèi)的人胎肝細胞,不需免疫抑制劑而能夠存活,并且保持人肝細胞的特性,產(chǎn)生人白蛋白,維持近12周.初步建立人鼠嵌合肝動物模型.2.給出生1周的移植了人胎肝細胞的大鼠接種HBV感染人血清,于4~12周齡可從血清中檢出HBsAg和HBV DNA,且肝組織有HB