人B種腺病毒的衣殼嵌合型疫苗候選及感染動(dòng)物模型研究.pdf

1、【目的】：
　　以人3型腺病毒（Ad3）載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建人腺病毒14型（Ad14）和55型（Ad55）表位嵌合型和六鄰體置換型重組腺病毒疫苗候選株，并探討建立人B種腺病毒感染動(dòng)物模型，為人腺病毒多價(jià)疫苗研究奠定基礎(chǔ)。
　　【方法】：
　　一、收集廣東省部分地區(qū)120份健康體檢人群的血清樣品，進(jìn)行細(xì)胞微量中和實(shí)驗(yàn)，調(diào)查血清抗人腺病毒3、4、7、14、55型中和抗體陽(yáng)性比率和滴度。
　　二、通過(guò)多重序列比對(duì)和同源建模

2、，預(yù)測(cè)Ad14和Ad55六鄰體蛋白的中和抗原表位，合成表位多肽，偶聯(lián)KLH后免疫小鼠，通過(guò)ELISA和細(xì)胞微量中和實(shí)驗(yàn)鑒定中和抗原表位；進(jìn)一步基因克隆獲得Ad14和Ad55中和抗原表位基因嵌入Ad3六鄰體的穿梭載體，細(xì)菌內(nèi)同源重組獲得重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染拯救表位嵌合型重組人3型腺病毒，生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定等方法分析重組腺病毒的生長(zhǎng)特性；純化病毒并免疫小鼠，ELISA和細(xì)胞微量中和實(shí)驗(yàn)分析表位嵌合型重組腺病毒的免疫原性。
　　三、PCR擴(kuò)增人14

3、型和55型腺病毒六鄰體基因，克隆到穿梭載體后，與人3型腺病毒載體進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)同源重組，拯救獲得六鄰體基因置換的衣殼嵌合型重組腺病毒rAd3H14和rAd3H55；生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定等方法分析重組腺病毒的特性；純化重組腺病毒并免疫小鼠，ELISA和細(xì)胞微量中和實(shí)驗(yàn)分析其免疫原性；將rAd3H14、rAd3H55與嵌合人7型腺病毒六鄰體的rAd3H7及母病毒rAd3EGFP進(jìn)行混合培養(yǎng)，六鄰體型特異Q-PCR和ELISA檢測(cè)分析混合培養(yǎng)產(chǎn)物中各型腺

4、病毒六鄰體的復(fù)制和表達(dá)，純化并免疫小鼠，或?qū)⑺姆N重組腺病毒同比例混合后免疫小鼠，檢測(cè)對(duì)人3、7、14、55型腺病毒的中和活性。
　　四、用人腺病毒3、4、7、14、55型感染小鼠、犬、金倉(cāng)鼠、豬、樹(shù)鼩等動(dòng)物的細(xì)胞系或原代細(xì)胞，通過(guò)Q-PCR和病毒感染滴度檢測(cè)分析其感染能力及復(fù)制和增殖能力，WB、電鏡等方法檢查病毒粒子結(jié)構(gòu)，為是否適合作為動(dòng)物模型提供一定的細(xì)胞水平的依據(jù)；嘗試滴鼻感染金倉(cāng)鼠、小型豬、樹(shù)鼩，采集咽拭子進(jìn)行Q-PCR檢測(cè)

5、，肺組織進(jìn)行Q-PCR檢測(cè)、HE染色，血清進(jìn)行體外中和實(shí)驗(yàn)等，初步篩選、建立腺病毒感染動(dòng)物模型。
　　【結(jié)果】：
　　一、120份健康成年人血清樣品中對(duì)Ad3、Ad4、Ad7、Ad14、Ad55中和抗體陽(yáng)性樣品的比例分別為80％、49.17%、85.83%、22.50%、20.83%，有較高滴度（>128）中和抗體的比例分別為61.67%、35.83%、59.17%、12.5%和14.16%，有高滴度（>512）中和抗體的比

6、例分別為19.17%、5.83%、25.83%、3.33%和4.33%；人群Ad4、Ad7和Ad55血清中和抗體陽(yáng)性率隨著年齡增大而升高，男女人群各型別腺病毒中和抗體比例沒(méi)有顯著差異。
　　二、預(yù)測(cè)Ad55六鄰體上4個(gè)中和抗原表位分別位于HVR1、HVR2、HVR4、HVR7，合成KLH偶聯(lián)肽免疫可以誘導(dǎo)出抗Ad55中和抗體；獲得這4個(gè)表位分別嵌入人3型腺病毒六鄰體相應(yīng)位置的重組腺病毒質(zhì)粒，但僅Ad3A55R2拯救到感染性病毒，免

7、疫小鼠后誘導(dǎo)出抗Ad3和Ad55的中和抗體。
　　三、預(yù)測(cè)Ad14六鄰體上4個(gè)中和抗原表位分別位于HVR1、HVR2、HVR4、HVR7，合成KLH偶聯(lián)肽免疫可以誘導(dǎo)出抗Ad14中和抗體；獲得這4個(gè)表位分別嵌入人3型腺病毒六鄰體相應(yīng)位置的重組腺病毒質(zhì)粒，但僅Ad3A14R2和Ad3A14R4拯救到感染性病毒，免疫小鼠后均誘導(dǎo)出抗Ad3和Ad14的中和抗體。
　　四、成功制備將rAd3EGFP的六鄰體分別置換為Ad14、Ad5

8、5六鄰體的重組腺病毒rAd3H14和rAd3H55，其復(fù)制增殖特性與rAd3EGFP無(wú)差異，免疫小鼠后誘導(dǎo)出高滴度的抗Ad14和Ad55中和抗體。制備六鄰體型特異表位肽抗血清和人3型和7型腺病毒型特異高中和滴度的單克隆抗體3D7等，建立了一套識(shí)別特異型別六鄰體蛋白的ELISA檢測(cè)體系；同時(shí)建立了一套識(shí)別特異型別六鄰體基因的Q-PCR檢測(cè)體系。rAd3EGFP、rAd3H7、rAd3H14、rAd3H55等四種重組腺病毒體外同比例混合后接

9、種細(xì)胞，復(fù)制效率相近，無(wú)顯著差異，ELISA檢測(cè)四種型別的六鄰體都可以檢測(cè)到?；旌吓囵B(yǎng)純化的腺病毒或各重組腺病毒同比例混合后免疫小鼠，都可以誘導(dǎo)出對(duì)四種型別腺病毒平衡的高滴度中和抗體應(yīng)答。
　　五、人3、4、14、55型腺病毒感染BALB/C小鼠原代肺、腎細(xì)胞后，觀(guān)察到很少量細(xì)胞病變，rAd3EGFP感染后可以觀(guān)察到少量細(xì)胞出現(xiàn)明顯的熒光；基因組拷貝數(shù)在48hr時(shí)出現(xiàn)下降，而96hr時(shí)又出現(xiàn)了上升；產(chǎn)生的子代病毒滴度約10-80之

10、間，較其在HEp2細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒滴度低10-100倍。人3、4、7、14、55型腺病毒感染金倉(cāng)鼠原代肺、腎細(xì)胞后，觀(guān)察到不明顯的少量細(xì)胞病變， rAd3EGFP感染后可以觀(guān)察到極其個(gè)別的細(xì)胞出現(xiàn)熒光；Q-PCR沒(méi)有檢測(cè)到病毒基因組拷貝數(shù)的顯著增長(zhǎng)。金倉(cāng)鼠用Ad55滴鼻攻毒3天后和6天后，肺部可見(jiàn)明顯局部實(shí)變，在9天后基本上已經(jīng)看不到實(shí)變。Ad4在攻毒9天后血清中和抗體滴度約64，而Ad3和Ad55在9天后誘導(dǎo)的血清中和抗體滴度約16-

11、32。
　　六、人腺病毒3、4、7、14和55型均可以有效感染豬腎細(xì)胞系PK15和豬原代上皮細(xì)胞，產(chǎn)生明顯的病變效應(yīng)，腎和肝原代細(xì)胞幾乎100%的細(xì)胞出現(xiàn)病變， Q-PCR檢測(cè)表明在豬上皮細(xì)胞內(nèi)人腺病毒基因組拷貝數(shù)有大量增加。但人腺病毒感染豬上皮細(xì)胞后產(chǎn)生的子代病毒感染性較低，對(duì)PK15培養(yǎng)的Ad3病毒顆粒進(jìn)行的電鏡、電泳、WB檢測(cè)表明其直徑大小、病毒顆粒成份和在人細(xì)胞中培養(yǎng)的正常成熟病毒顆粒存在明顯差異。Ad3經(jīng)鼻、靜脈注射感染

12、五指山小型豬均可以引起肺組織嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，但較快痊愈。
　　七、人腺病毒3、4、7、14、55型感染樹(shù)鼩肺、腎、氣管原代細(xì)胞后都可以觀(guān)察到典型CPE，rAd3EGFP感染樹(shù)鼩原代細(xì)胞可以觀(guān)察到強(qiáng)烈的熒光；病毒基因組拷貝數(shù)在感染后48hr即有極大增加（100-1000倍），產(chǎn)生的子代病毒滴度與在對(duì)照HEp2中產(chǎn)生的子代病毒滴度相近。Ad55對(duì)樹(shù)鼩滴鼻攻毒后，部分動(dòng)物咽拭子中病毒滴度在6天后仍有升高，所有動(dòng)物肺組織均可見(jiàn)大面積或局部實(shí)

13、變，病理切片檢查發(fā)現(xiàn)部分動(dòng)物有嚴(yán)重肺部炎癥，個(gè)別動(dòng)物9天后仍表現(xiàn)為嚴(yán)重肺炎。感染后6天血清中和抗體滴度達(dá)到256-512倍，9天達(dá)到512-1024倍。
　　七、人腺病毒3、4、7、14、55型感染樹(shù)鼩肺、腎、氣管原代細(xì)胞后都可以觀(guān)察到典型CPE，rAd3EGFP感染樹(shù)鼩原代細(xì)胞可以觀(guān)察到強(qiáng)烈的熒光；病毒基因組拷貝數(shù)在感染后48hr即有極大增加（100-1000倍），產(chǎn)生的子代病毒滴度與在對(duì)照HEp2中產(chǎn)生的子代病毒滴度相近。Ad

14、55對(duì)樹(shù)鼩滴鼻攻毒后，部分動(dòng)物咽拭子中病毒滴度在6天后仍有升高，所有動(dòng)物肺組織均可見(jiàn)大面積或局部實(shí)變，病理切片檢查發(fā)現(xiàn)部分動(dòng)物有嚴(yán)重肺部炎癥，個(gè)別動(dòng)物9天后仍表現(xiàn)為嚴(yán)重肺炎。感染后6天血清中和抗體滴度達(dá)到256-512倍，9天達(dá)到512-1024倍。
　　【結(jié)論】：
　　一、南方地區(qū)普通成年人群有高比例和較高滴度的Ad3和Ad7血清中和抗體，有較高比例的Ad4中和抗體，普遍缺乏對(duì)Ad14和Ad55的保護(hù)性抗體，有接種Ad14

15、和Ad55疫苗的必要性。
　　二、人55型腺病毒六鄰體的氨基酸138 to152位點(diǎn)(A55R1)、179-187位點(diǎn)(A55R2)、247-259位點(diǎn)(A55R4)、429-443位點(diǎn)(A55R7)包含中和抗原表位；表位嵌合型腺病毒rAd3A55R2免疫小鼠可以誘導(dǎo)抗Ad3和Ad55的中和抗體應(yīng)答，可以作為人3型和55型雙價(jià)疫苗候選株。
　　三、人14型腺病毒六鄰體的氨基酸141-157位點(diǎn)(A14R1)、181-189位

16、點(diǎn)(A14R2)、252-260位點(diǎn)(A14R4)和430-442位點(diǎn)(A14R7)包含中和抗原表位；表位嵌合型腺病毒rAd3A14R2和rAd3A14R4免疫小鼠可以誘導(dǎo)抗Ad3和Ad14的中和抗體應(yīng)答，可以作為人3型和14型雙價(jià)疫苗候選株。
　　四、成功制備六鄰體置換的衣殼嵌合型重組腺病毒rAd3H14和rAd3H55，可以分別作為Ad14和Ad55疫苗候選株。六鄰體是人3、14、55型腺病毒在人體和小鼠體內(nèi)中和抗體識(shí)別的主要

17、抗原。rAd3E、rAd3H7、rAd3H14和rAd3H55四種重組病毒混合培養(yǎng)后以相近的效率復(fù)制和增殖，同比例混合免疫可以誘導(dǎo)平衡的抗Ad3、7、14和55型腺病毒的中和抗體應(yīng)答，可以作為一種多價(jià)疫苗候選。
　　五、人B種腺病毒3、7、14、55型均可以感染豬上皮細(xì)胞并高效復(fù)制，但只能產(chǎn)生低滴度的感染性病毒；滴鼻和靜脈攻毒可以導(dǎo)致小型豬肺部炎癥反應(yīng)。
　　六、人B種腺病毒3、7、14、55型對(duì)小鼠、金倉(cāng)鼠上皮細(xì)胞的感染能