寨卡病毒感染小鼠動(dòng)物模型的建立及其應(yīng)用.pdf

1、寨卡病毒(ZIKV)屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)，病毒顆粒呈球形，直徑為40-70nm，有包膜的單股正鏈RNA病毒，分為亞洲和非洲兩個(gè)基因型。目前，在南美地區(qū)流行的病毒基因型是亞洲型。埃及伊蚊為寨卡病毒的主要傳播媒介。2015年以來，寨卡疫情在全球多地肆虐，特別是南美洲、中北美洲及加勒比海地區(qū)疫情嚴(yán)重，且疫情至今不斷發(fā)展，呈現(xiàn)蔓延擴(kuò)大趨勢(shì)和跨境傳播風(fēng)險(xiǎn)，已波及全球70多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，預(yù)計(jì)每年感

2、染人數(shù)超過200萬。截止2016年10月我國(guó)已報(bào)道20余例輸入性病例。鑒于寨卡病毒與小頭畸形、格林-巴利綜合癥等嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切關(guān)聯(lián)，此次寨卡疫情被世界衛(wèi)生組織宣布為“國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”。
　　由于此次寨卡病毒病暴發(fā)的廣泛性、復(fù)雜性和嚴(yán)重性，對(duì)病毒的基本生物學(xué)特征和致病機(jī)制所致甚少，而病毒毒力、傳播性和致病性均不明確，疫苗、抗體和藥物缺乏，嚴(yán)重制約了寨卡疫情的科學(xué)防控。因此，建立當(dāng)前流行寨卡病毒感染的動(dòng)物模型，為闡明

3、寨卡病毒致病機(jī)理、加快疫苗和抗病毒藥物研發(fā)及防控寨卡疫情提供重要支撐是我們亟待解決的問題。
　　小鼠不僅是研究病毒致病機(jī)理的重要工具，也是評(píng)價(jià)藥物及疫苗有效性和安全性不可替代的重要手段。小鼠性格溫順易飼養(yǎng)，體積小巧易于操作，繁殖能力強(qiáng)，大多數(shù)對(duì)病毒易感，已廣泛應(yīng)用于各種病毒致病機(jī)理研究以及疫苗和藥物評(píng)價(jià)。
　　本研究首先利用蟲媒病毒分離鑒定技術(shù)平臺(tái)分離獲得寨卡病毒臨床分離株，并對(duì)其基因組特征、空斑大小、一步生長(zhǎng)特性及乳鼠神經(jīng)

4、毒力等進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定;在此基礎(chǔ)上，分別建立了寨卡病毒感染的免疫健全129小鼠和免疫缺陷型A129小鼠動(dòng)物模型，動(dòng)態(tài)觀察其體重變化、臨床癥狀，以及病毒血癥和組織臟器分布等一系列指標(biāo)，初步明確了我國(guó)分離的寨卡病毒毒株在不同小鼠上的生物學(xué)特征;最后，利用病人恢復(fù)期血清抗體及抗病毒藥物NITD008在小鼠體內(nèi)的保護(hù)和治療效果，驗(yàn)證小鼠動(dòng)物模型的實(shí)用性和有效性。
　　一、寨卡病毒的分離與鑒定
　　為了獲得我國(guó)輸入性寨卡病毒臨床分離株，

5、我們將患者的尿液接種乳鼠鼠腦。結(jié)果顯示，乳鼠鼠腦接種后7天開始出現(xiàn)典型的神經(jīng)癥狀，實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)到寨卡病毒在鼠腦內(nèi)大量擴(kuò)增;間接免疫熒光結(jié)果表明，病人恢復(fù)期血清與分離得到的病毒特異性結(jié)合。蝕斑顯示，新分離病毒可感染BHK-21細(xì)胞并形成大小均一、邊緣清晰的典型蝕斑。電鏡結(jié)果顯示，寨卡病毒顆粒呈圓形，表面光滑，直徑大小約40nm。序列分析結(jié)果進(jìn)一步顯示，分離獲得的寨卡病毒SZ01株屬于亞洲譜系，與法屬波利尼西亞分離的H/PF/2

6、013毒株具高度同源性。最后，在1日齡乳鼠上評(píng)價(jià)了新分離毒株的致病性。結(jié)果顯示，乳鼠在接種103pFU病毒后第9天出現(xiàn)弓背、四肢麻痹振顫以及嗜睡等癥狀，并開始死亡;同時(shí)，在接種12天后的各種組織臟器中均可檢測(cè)到較高滴度的病毒核酸。上述結(jié)果表明，我們成功分離獲得了我國(guó)境外輸入性寨卡病毒毒株，這為后續(xù)動(dòng)物模型建立和評(píng)價(jià)提供了可靠的毒種資源。
　　二、寨卡病毒感染小鼠動(dòng)物模型的建立
　　為了建立寨卡病毒感染小鼠模型，本研究分別以免

7、疫健全的129小鼠及IFN-α/β受體缺陷的A129小鼠為研究對(duì)象，并經(jīng)腹腔途徑接種105PFU病毒。結(jié)果顯示，129小鼠感染寨卡病毒后第1天即出現(xiàn)病毒血癥高峰，滴度106 RNA copies/ml，逐漸降低，在第3天完全消失;A129小鼠感染后病毒血癥可持續(xù)7天左右，第2天達(dá)到病毒血癥高峰，滴度為5.13×108 RNAcopies/ml。組織臟器實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，129小鼠和A129小鼠感染寨卡病毒后在各種臟器中均

8、檢測(cè)到病毒核酸。上述結(jié)果表明，成功建立了寨卡病毒感染的小鼠模型，相關(guān)數(shù)據(jù)為下一步疫苗和抗病毒藥物的評(píng)價(jià)提供有益參考。
　　三、小鼠動(dòng)物模型在抗寨卡病毒藥效學(xué)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用
　　本研究進(jìn)一步利用寨卡病人恢復(fù)期血清抗體及抗病毒藥物NITD008驗(yàn)證了所建立模型的實(shí)用性和有效性。首先，體外抗病毒活性檢測(cè)結(jié)果顯示，病人恢復(fù)血清抗體可有效的抑制寨卡病毒的復(fù)制，中和效價(jià)為1∶161;NITD008可有效抑制病毒感染且呈劑量依賴關(guān)系，藥物濃

9、度越高，病毒的感染效率越低。然后，體外治療結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，抗體能完全清除寨卡病毒感染129小鼠的病毒血癥，并能清除小鼠脾臟和睪丸中的病毒載量。NITD008治療組A129小鼠病毒血癥明顯降低2.6倍，其小鼠存活率達(dá)70％，且存活的小鼠無任何疾病癥狀出現(xiàn)。上述結(jié)果表明本研究所建立的小鼠模型可應(yīng)用于抗寨卡病毒藥物和抗體評(píng)價(jià)，同時(shí)，也將為今后寨卡病毒疫苗及抗病毒藥物研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。
　　綜上所述，本研究成功分離獲得了當(dāng)前流行寨