隱孢子蟲的小鼠動(dòng)物模型建立及PCR檢測和RFLP鑒定.pdf

1、本論文從隱孢子蟲小鼠動(dòng)物模型的建立、NTZ對免疫小鼠的抗隱孢子蟲活性、常規(guī)及通用引物對隱孢子蟲的檢測、Nested-PCR加RFLP對隱孢子鑒定等幾個(gè)方面進(jìn)行了研究。 實(shí)驗(yàn)一對隱孢子蟲種進(jìn)行了模型建立的探索，對不同蟲種(C.parvum和C.andersoni)是否具有感染性、不同品系(BALB/c和昆明KM)和鼠齡(斷乳兩天、5～6周齡、10-12周齡)、不同免疫抑制劑量(每升飲水中分別加DEX0mg、2.5mg、5mg、7.

2、5mg、10mg、12.5mg)對小鼠感染隱孢子蟲的影響、隱孢子蟲的卵囊不同接種量(1.5×104個(gè)、1.5×103個(gè)、1.5×102個(gè)、75個(gè))和不同保存時(shí)間(1、2、6、8個(gè)月)的卵囊對感染情況的影響進(jìn)行了詳細(xì)的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：C.parvum蟲種能夠感染上本實(shí)驗(yàn)所采用的BALB/c和昆明(KM)小白鼠兩種小鼠，而C.andersoni沒有能夠感染本次實(shí)驗(yàn)小鼠；且從小鼠感染后的排卵囊量和小鼠的生存狀態(tài)來看，采用5～6周齡的KM鼠

3、能獲得最大量的隱孢子蟲卵囊，小鼠的死亡數(shù)最少；每升飲水中地塞米松(DEX)量為7.5mg～10mg組比12.5mg以上組小鼠死亡數(shù)量少，比5mg/L以下組排卵囊數(shù)量多；接種不同卵囊數(shù)和卵囊的保存時(shí)間這兩個(gè)參數(shù)均對小鼠受感染后的排卵囊情況影響不大。另外對NTZ對免疫小鼠的抗隱孢子蟲活性試驗(yàn)進(jìn)行了研究，采用本實(shí)驗(yàn)建立的隱孢子蟲小鼠模型，設(shè)立50mg/kg/d、100mg/kg/d、200mg/kg/d及空白對照組對NTZ的藥效學(xué)進(jìn)行了研究，

4、結(jié)果表明：NTZ在免疫抑制小鼠模型中具有抗隱孢子蟲的活性，有效劑量為200mg/kg/d。 實(shí)驗(yàn)二對隱孢子蟲進(jìn)行了三種不同的常規(guī)檢測，分別為飽和蔗糖漂浮鏡檢法、飽和鹽水漂浮鏡檢法和改良抗酸染色法；并設(shè)計(jì)一對通用引物進(jìn)行PCR檢測和對PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測序。常規(guī)檢測的結(jié)果表明：飽和蔗糖漂浮法能清楚的分辨出卵囊，但由于卵囊在飽和蔗糖中保存時(shí)間不能太久，不適合大批量的樣品檢測；飽和鹽水漂浮法也能較快清楚的檢測出卵囊，但由于純化過程中

5、不能清除各種雜質(zhì)，對比不明顯，檢出率沒有飽和蔗糖漂浮法高；改良抗酸染色法能很清晰的檢測出隱孢子的卵囊，但可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果，且檢出率也不是很高。但這三種常規(guī)的檢測方法所需的實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡單，操作技術(shù)要求難度不大，適合于臨床急性病例的檢測。本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的通用引物能一次性的檢測出目前國內(nèi)哺乳動(dòng)物所感染的兩種不同的隱孢子蟲種，并通過克隆測序表明此段克隆的PCR產(chǎn)物為兩種隱孢子蟲18SrRNA基因所共有。PCR方法具有簡單、快速、特異性高等特點(diǎn)，且

6、敏感性比常規(guī)方法要高出100倍以上。 實(shí)驗(yàn)三進(jìn)行了Nested-PCR加RFLP對隱孢子鑒定的研究。根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，和從www.ncbi.nlm.nih.gov的GenBank上下載的隱孢子蟲18SrRNA基因序列，設(shè)計(jì)兩對特殊的引物：外引物前：5-GGGTTGTATTTATTAGATAAAGAAC-3外引物后：5-TCACTCCACCAACTAAGAACGG-3和內(nèi)引物前：5-GAAACGGCTACCACATCTAAGG-3

7、內(nèi)引物后：5-GAAGGAGTAAGGAACAACC-3進(jìn)行Nested-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出一段長約為1100bp和一段長約為660bp的序列，并分別對它們克隆測序，根據(jù)測序結(jié)果，利用Prime5.0輔助軟件，分別找到C.p和C.a合適的酶切位點(diǎn)，用Ssp1和Dral兩種限制性內(nèi)切酶對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在相同的溫度和時(shí)間內(nèi)分別進(jìn)行酶切，其中C.a酶切成260bp和385bp兩段；C.p酶切成120bp和553bp兩段，此方法能將兩種不同的隱