2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、背景:
  大量研究表明,神經(jīng)管畸形(NTDs)20%由遺傳因素造成,80%由非遺傳因素造成,但詳細(xì)機(jī)制尚未完全清楚。葉酸缺乏是導(dǎo)致NTDs發(fā)生重要病因之一,是近年來(lái)NTDs研究的最重要成果。大約50-70%的NTDs可通過(guò)適當(dāng)補(bǔ)充葉酸有效預(yù)防,因此,以葉酸為切入點(diǎn),研究NTDs的具體發(fā)病機(jī)制對(duì)NTDs的防治有著重要的意義。
  值得注意的是,迄今為止,未見(jiàn)通過(guò)單純飲食控制成功建立葉酸缺乏誘導(dǎo)的NTDs動(dòng)物模型的報(bào)道,我們前

2、期根據(jù)葉酸缺乏是通過(guò)葉酸不同代謝途徑的代謝障礙間接導(dǎo)致NTDs及其他發(fā)育障礙的假設(shè),阻斷葉酸相應(yīng)的葉酸代謝通路,成功制備了二氫葉酸還原酶、核苷酸還原酶、胸苷酸合成酶、甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)代謝途徑障礙NTDs小鼠系列動(dòng)物模型,并證實(shí)以上關(guān)鍵酶所涉及的相關(guān)代謝通路障礙均可獨(dú)立引起NTDs的發(fā)生。為深入探索葉酸缺乏導(dǎo)致NTDs及出生發(fā)育障礙提供了模型基礎(chǔ),通過(guò)不同模型的比較,可進(jìn)一步證實(shí)葉酸不同代謝途徑引起NTDs及出生缺陷的代謝機(jī)理。
  

3、本文涉及的甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰基轉(zhuǎn)移酶(GARFT)也是葉酸實(shí)現(xiàn)其生物效應(yīng)的相關(guān)代謝通路關(guān)鍵酶之一,抑制其活性造成相關(guān)代謝障礙,是否可以誘發(fā)NTDs及其初步的分子機(jī)制是本文擬解決的科學(xué)問(wèn)題。本科學(xué)問(wèn)題的證實(shí)不僅對(duì)闡明葉酸的不同代謝途徑與NTDs及發(fā)育障礙的關(guān)系有著重要的意義,同時(shí)為在單純嘌呤單核苷酸代謝障礙的條件下進(jìn)一步研究NTDs及發(fā)育障礙的機(jī)制提供了重要模型基礎(chǔ)。該方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。
  目的:
  1、采用甘氨酰

4、胺核糖核苷酸甲?;D(zhuǎn)移酶(Glycinamide ribonucleotide formyl transferase, GARFT)特異性抑制劑洛美曲松(Lometrexol,dideazatetrahydrofolic acid,DDATHF)對(duì)懷孕小鼠進(jìn)行干預(yù),誘導(dǎo)出嘌呤代謝異常的小鼠NTDs。
  2、觀察DDATHF誘導(dǎo)的小鼠NTDs胚胎組織GARFT酶活性及嘌呤代謝的情況。
  3、研究DDATHF干擾嘌呤從頭代謝

5、對(duì)小鼠NTDs胚胎組織細(xì)胞增殖和凋亡的作用。
  4、研究DDATHF誘導(dǎo)的GAR-FGAR代謝障礙小鼠胚胎干細(xì)胞增殖和凋亡的作用。
  方法:
  將19-21gC57BL/6J孕鼠隨機(jī)分組,實(shí)驗(yàn)組于孕7.5(E7.5)天腹腔DDATHF給藥,生理鹽水為對(duì)照組。孕11.5(E11.5)天,取出胚胎,鏡下觀察胚胎神經(jīng)管及畸形的形態(tài)特征;利用組胚病理學(xué)方法進(jìn)一步觀察胚胎組織結(jié)構(gòu)畸變情況;用GARFT酶活性測(cè)定試劑盒和高效

6、液相色譜法在不同時(shí)間點(diǎn)(0h,6h,24h,48h,96h)測(cè)定胚胎組織的GARFT活性及ATP、GTP、dATP和dGTP的含量;通過(guò)免疫組化、實(shí)時(shí)熒光定量PCR及 Western-Blot的方法,分析DDATHF制備的NTDs凋亡及增殖的狀況。CCK-8,流式細(xì)胞法及慧星實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析DDATHF對(duì)小鼠D3胚胎干細(xì)胞增殖和凋亡的作用。
  結(jié)果:
  1、DDATHF成功誘導(dǎo)出小鼠NTDs,最佳劑量為45 mg/kg,N

7、TDs發(fā)生率為31.7%,小鼠NTDs主要表現(xiàn)后腦神經(jīng)管未閉,其它畸形主要為顱面畸形和發(fā)育遲緩,HE染色可見(jiàn)神經(jīng)管畸形胎鼠后腦泡未閉合。
  2、GARFT活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)E7.5腹腔注射DDATHF后,胚胎組織中DDATHF活性約在6小時(shí)降到最低,在注射DDATHF96小時(shí)后,GARFT活性仍然低于正常水平。
  3、HPLC結(jié)果顯示,DDATHF誘導(dǎo)的NTDs胚胎組織中ATP、GTP、dATP和dGTP的含量在腹腔注射DDA

8、THF后均逐漸降低,在注射DDATHF96小時(shí)后其含量仍低于正常水平。
  4、采用免疫組化方法檢測(cè)Phospho-Histone H3(PH3)和Caspase-3(Casp-3)在胎鼠神經(jīng)管神經(jīng)上皮細(xì)胞的表達(dá)情況情況,PH3在NTDs組胚胎組織細(xì)胞的表達(dá)明顯低于對(duì)照組,Casp-3在NTDs組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯多與對(duì)照組(P<0.05)。
  5、Western-Blot檢測(cè)小鼠胚胎組織中PH3蛋白和Casp-3蛋白的表達(dá)

9、水平, PH3蛋白含量明顯低于對(duì)照組,Casp-3蛋白在NTDs組表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。
  6、采用RT-PCR的方法檢測(cè)小鼠胚胎組織中Pcna,F(xiàn)oxg1,Ptch1,Apaf1,Casp-3和Casp-9的表達(dá)量,NTDs胚胎組織中Pcna,F(xiàn)oxg1和Ptch1的表達(dá)量顯著低于正常組,Apaf1,Casp-3和Casp-9的表達(dá)量在NTDs組明顯升高(P<0.05)。
  7、CCK-8、Brdu流式細(xì)胞術(shù)

10、檢測(cè)DDATHF抑制D3鼠胚胎干細(xì)胞(ESC)細(xì)胞增殖(P<0.05)。
  8、AnnexinV/PI雙染法、線粒體膜電位法及慧星電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DDATHF誘導(dǎo)ESC細(xì)胞凋亡(P<0.05)。
  結(jié)論:
  1、成功建立DDATHF致C57BL/6J小鼠胚胎NTDs動(dòng)物模型。
  2、研究表明了嘌呤代謝異常與NTDs相關(guān),為葉酸缺乏引起NTDs的機(jī)制研究作了重要補(bǔ)充。
  3、DDATHF可引起胚胎組織細(xì)

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