抗人CD40人-鼠嵌合抗體的構(gòu)建表達(dá)及功能的初步研究.pdf

1、本研究在自行成功研制的鼠抗人CD40激發(fā)型單克隆抗體（5C11）和鼠抗人muCD40單克隆抗體（5H6）的基礎(chǔ)上，采用嵌合抗體構(gòu)建方法，在真核細(xì)胞293T中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)方法提高嵌合抗體表達(dá)量，并對(duì)嵌合抗體生物學(xué)功能進(jìn)行初步研究。
　　 第一部分：CD40人-鼠嵌合抗體的構(gòu)建、表達(dá)及功能初步研究
　　 從5C11雜交瘤細(xì)胞中抽取總RNA，常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄，應(yīng)用簡并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，釣取重鏈Fd及輕鏈基因。根據(jù)重

2、、輕鏈基因序列設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增VH和VL基因。雙酶切裝載有信號(hào)肽序列及人IgGlγ-鏈的Fc、CH1基因的重鏈表達(dá)載體pCMV-VH以及裝載有信號(hào)肽序列及κ鏈的Cκ基因的輕鏈表達(dá)載體pCMV-VL。將同樣雙酶切的VH和VL基因連接入表達(dá)載體，構(gòu)建成嵌合抗體（ch5C11）的輕鏈真核表達(dá)載體5C11L-pCMV及重鏈真核表達(dá)載體5C11H-pCMV。將嵌合抗體的輕重鏈真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，利用夾心ELISA法測定上

3、清中c5C11的濃度，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測c5C11與膜抗原的特異性結(jié)合。選擇天然高表達(dá)CD40分子的人B淋巴瘤細(xì)胞株Daudi（陽性表達(dá)率>90％）與ch5C11共培養(yǎng)，鏡下觀察細(xì)胞生長形態(tài)，CCK-8分析ch5C11對(duì)Daudi細(xì)胞的生長與存活的影響。研究結(jié)果表明：成功構(gòu)建了分別含嵌合重、輕鏈基因的真核表達(dá)載體5C11H-pCMV及5C11L-pCMV，并在293T細(xì)胞中得到瞬時(shí)表達(dá)。ch5C11能夠有效識(shí)別Daudi細(xì)胞膜型CD40

4、分子。ch5C11能有效抑制Daudi細(xì)胞體外增殖。提示CD40嵌合抗體具有良好的生物學(xué)活性。
　　 通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)方法對(duì)c5C11的氨基酸序列進(jìn)行改造，分析并設(shè)計(jì)突變影響嵌合抗體表達(dá)量的氨基酸。將改造后的輕鏈表達(dá)載體5C11L-pCMV及重鏈表達(dá)載體5C11H（M）-pCMV共轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞。利用夾心ELISA法測定上清中ch5C11的濃度，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測ch5C11與膜抗原的特異性結(jié)合。選擇天然高表達(dá)CD40分子

5、的人B淋巴瘤細(xì)胞株Daudi（陽性表達(dá)率>90％）與ch5C11（M）共培養(yǎng)，鏡下觀察細(xì)胞生長形態(tài)，CCK-8分析ch5C11（M）對(duì)Daudi細(xì)胞的生長與存活的影響。結(jié)果表明：ch5C11（M）表達(dá)量有較顯著的提高。ch5C11（M）能夠有效識(shí)別Daudi細(xì)胞膜型CD40分子。ch5C11能有效抑制Daudi細(xì)胞體外增殖。提示CD40嵌合抗體具有良好的生物學(xué)活性。
　　 第二部分：muCD40人-鼠嵌合抗體的構(gòu)建、表達(dá)及功能初

6、步研究
　　 從5H6雜交瘤細(xì)胞中抽取總RNA，常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄，應(yīng)用簡并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，釣取重鏈Fd及輕鏈基因。根據(jù)重、輕鏈基因序列設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增VH和VL基因。雙酶切裝載有信號(hào)肽序列及人IgGlγ鏈的Fc、CH1基因的重鏈表達(dá)載體pCMV-VH以及裝載有信號(hào)肽序列及κ鏈的Cκ基因的輕鏈表達(dá)載體pCMV-VL。將同樣雙酶切的VH和VL基因連接入表達(dá)載體，構(gòu)建成嵌合抗體（ch5H6）的輕鏈真核表達(dá)載體5H6L-pCM

7、V及重鏈真核表達(dá)載體5H6H-pCMV。將嵌合抗體的輕重鏈真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，利用夾心ELISA法測定上清中ch5H6的濃度，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測ch5H6與膜抗原的特異性結(jié)合。
　　 綜上所述：1、成功構(gòu)建了抗人CD40人-鼠嵌合抗體（ch5C11）。2、CD40嵌合抗體可有效抑制天然高表達(dá)CD40分子的人B淋巴瘤細(xì)胞株Daudi的體外增殖。3、通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)方法對(duì)ch5C11的氨基酸序列進(jìn)行改造后，瞬時(shí)表達(dá)量