重組鼠抗人CD19單鏈抗體的構(gòu)建和表達.pdf

1、兒童急性白血病是嚴重危害兒童健康的頑癥，聯(lián)合化療是目前治療該疾病的主要方法。急性B淋巴細胞白血病(B系ALL)是兒童白血病中的常見類型。CD19分子是一個B細胞系特異的細胞表面分化抗原，在B祖細胞階段出現(xiàn)并穩(wěn)定持續(xù)地·表達，在B系ALL的陽性表達率達99.1％，而在髓系細胞、紅系細胞、T細胞、造血干細胞以及非造血組織器官細胞上無表達。因此，抗人CD19抗體可能是一個生物靶向治療B系ALL的良好制劑。 本實驗室前期研究已經(jīng)基本確

2、定了2E8抗體輕、重鏈可變區(qū)基因(簡稱VL2E8和VH2E8)序列，用DNASISver2.5軟件對該基因進行分析和國際互聯(lián)網(wǎng)檢索，表明它們符合鼠免疫球蛋白可變區(qū)基因的開放閱讀框，但對其是否就是原抗體可變區(qū)的編碼基因序列尚未證實。本研究擬采用RT-PCR、TA克隆、抽提質(zhì)粒、酶切連接等一系列分子生物學方法克隆ScFV2E8基因，構(gòu)建真核表達載體pSectag2A/ScFV2E8，并通過轉(zhuǎn)染建立轉(zhuǎn)基因中華倉鼠卵巢(CHO)細胞株，表達獲得

3、ScFV2E8抗體蛋白并初步鑒定其生物活性，為該抗體進一步進行人源化基因改造奠定基礎。材料與方法 1、雜交瘤細胞的復蘇與培養(yǎng)：按照常規(guī)方法進行。 2、VH2E8、VL2E8及ScFv2E8基因的克隆與測序：收集處于對數(shù)生長期的2E8雜交瘤細胞1x107，PBS離心(1500rpmx5min)洗滌2次后，用Trizol試劑盒按說明抽提總RNA，采用帶有特定酶切位點的引物和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和重疊延伸拚接法

4、(splicingbyoverlapextension，SOE)擴增VH2E8、VL2E8和ScFv2E8基因，將目的基因片斷通過TA克隆的方法對其進行測序核實。 3、分泌型真核表達載體的構(gòu)建：將位于TA克隆載體pGEM(R)-Teasyvector中并業(yè)已測序核實的ScFV2E8基因通過酶切處理后得到的ScFV2E8基因片段和pSectag2A空載體片段，經(jīng)過連接、轉(zhuǎn)化、篩選、抽提質(zhì)粒、酶切鑒定等步驟后，測序核實，第2頁從而獲

5、得重組質(zhì)粒pSectag2A/ScFv2E8。 4、轉(zhuǎn)基因CHO細胞株的建立：通過Superfecttransfectionreagent轉(zhuǎn)染試劑盒將pSectag2A/ScFv2E8穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至真核細胞CHO細胞中，并用Zeosin進行培養(yǎng)篩選，從而獲得帶有重組質(zhì)粒(pSeectag2A/ScFv2E8)的轉(zhuǎn)基因CHO細胞株CHO/pSectag2A/ScFv2E8。 結(jié)論1、本研究成功克隆到2E8抗體的VH2E8和VL