鼠抗人CD14新克隆ZCH-7-2F9單鏈抗體的研究.pdf

1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文鼠抗人CD14新克隆ZCH72F9單鏈抗體的研究姓名：寧鉑濤申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：兒科學(xué)（血液腫瘤學(xué)）指導(dǎo)教師：湯永民20050501浙江大學(xué)博士學(xué)位論文鼠抗人CDl4新克隧ZCH一7—2F9單鏈抗體的研究和輕鏈可變區(qū)(VL)基因進(jìn)行克隆測序，并將2F9單抗制各成，j、分子抗體ScFV2F9對這一抗體片段進(jìn)行了純化、復(fù)性和體外活性的研究。一、2F9單抗輕重鏈可變區(qū)基因克隆與序列分析復(fù)蘇并亞克隆2F9雜交瘤細(xì)胞株，獲

2、得高純度的細(xì)胞株93A10采用反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)，從93A10雜交瘤細(xì)胞中克隆到了該抗體的VH和VL基因，TA克隆并測序分析。VL”9基因全長321bps，VH2F9基因全長360bps，分別編碼107和120個(gè)氨基酸殘基?；ヂ?lián)網(wǎng)在線分析結(jié)果表明：VL2F9含有明確的4個(gè)框架區(qū)(FR)和3個(gè)抗原決定簇互補(bǔ)區(qū)(CDR)，在第23位和第88位為特征性半胱氨酸：VH2F9含有明確的4個(gè)框架區(qū)和3個(gè)抗原決定簇互補(bǔ)區(qū)，在第22位和

3、第96位為特征性半胱氨酸。二、ScFv2F9原核和真核表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)VH2F9、VL2F”(G4S)3基因序列以及空載體多克隆位點(diǎn)內(nèi)切酶的核酸序列設(shè)計(jì)引物，采用高保真的Taq酶，通過重疊延伸拚接法(splicingbyoverlapextension，SOE)擴(kuò)增克隆到ScFv2F9基因，測序核實(shí)后分別克隆到pIVE)(23一MCS和pSecta92A空載體中，成功構(gòu)建了ScFvm的原核表達(dá)載體plVEX23MCSIScFv2F9和

4、真核分泌型表這載體pSecta92A／ScFV2F9。三、直標(biāo)鼠抗人CDl4新克隆2F9FITC的研制及鑒定在清潔級BALB／c小鼠腹腔注射2F9細(xì)胞，制備大量腹水。硫酸銨初步純化后采用EconoPac蛋白A柱進(jìn)行親和層析，SDSRAGE檢測純化蛋白的純度。將獲得的純化2F9單抗，通過改良Marsshall法，用異硫氰酸熒光囊(Fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)rrC)進(jìn)行標(biāo)記，多余FITC經(jīng)PBS充分透析除去，用紫