抗?jié)h坦病毒鼠-人嵌合抗體真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、漢坦病毒（Hantavirus）屬于布尼亞病毒科漢坦病毒屬，根據(jù)其抗原性和基因結(jié)構(gòu)的不同，可分為10多個(gè)型別。Hantavirus可引起兩種類型的急性傳染病，一類以高熱、彌漫性肺部炎癥和急性呼吸衰竭為主要表現(xiàn)，稱為漢坦病毒肺綜合征（hantavirus pulmonary syndrome，HPS），另一類以出血、高熱、腎功能損害為主要表現(xiàn)，稱為腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome，

2、HFRS）。迄今為止，在我國尚未發(fā)現(xiàn)HPS的報(bào)道，但我國是世界上受HFRS危害最嚴(yán)重的國家。該病在我國具有發(fā)病人數(shù)多、流行范圍廣、死亡率高等特點(diǎn)。此外，Hantavirus還是一種潛在的生物戰(zhàn)劑，有被恐怖分子利用的可能。而且目前臨床上尚未有能特異治療HFRS的有效藥物，因而更增加了HFRS的艱巨性和長期性。
　　用疫苗進(jìn)行主動(dòng)免疫和用抗體進(jìn)行被動(dòng)免疫治療是當(dāng)前預(yù)防和治療病毒性疾病的重要措施。近年來國內(nèi)外已研制出Hantavirus

3、的純化細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗和純化乳鼠腦滅活疫苗，但這兩類疫苗在試用過程中表現(xiàn)出明顯不足。使用具有中和活性的單克隆抗體(monoclonal antibody,mAb)是在體內(nèi)、外抑制或阻斷病毒感染的有效的治療方法之一。早在上世紀(jì)八十年代中期本實(shí)驗(yàn)室即研制出具有較高中和活性和保護(hù)性的抗Hantavirus mAb，并在國家863計(jì)劃支持下研制注射用抗HFRS病毒單克隆抗體制劑，現(xiàn)已完成臨床試驗(yàn)。由于鼠源性mAb對人有潛在的免疫原性，可能引起超

4、敏反應(yīng)等副作用，因此，本課題擬在此基礎(chǔ)上對抗Hantavirus鼠源性mAb 3G1進(jìn)行人源化改造，應(yīng)用基因重組技術(shù)，構(gòu)建鼠/人嵌合抗體基因，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)并篩選出穩(wěn)定高效表達(dá)嵌合抗體的細(xì)胞系，純化表達(dá)的嵌合抗體并鑒定其生物學(xué)特性，為進(jìn)一步研制特異治療HFRS的新型制劑奠定基礎(chǔ)。
　　1.構(gòu)建抗?jié)h坦病毒鼠/人嵌合抗體的真核表達(dá)載體
　　以pCI-neo-M和pCI-M載體為基礎(chǔ)，用ease2.1-cmv5分別替換pCI

5、-neo-M和pCI-M的啟動(dòng)子MARs-mCMV改建真核表達(dá)載體，改構(gòu)后的載體命名為pCI-neo-ease2.1-cmv5-M和pCI-ease2.1-cmv5-M；獲得抗HTNV mAb 3G1的鼠/人嵌合輕鏈、重鏈基因，并分別將其克隆到pCI-neo-ease2.1-cmv5-M和pCI-ease2.1-cmv5-M真核表達(dá)載體中，經(jīng)雙酶切鑒定后分別獲得陽性重組質(zhì)粒pCI-neo-ease2.1-cmv5-vh-M和pCI-ea

6、se2.1-cmv5-vl-M，測序后證實(shí)載體構(gòu)建成功。
　　2.穩(wěn)定表達(dá)抗?jié)h坦病毒鼠/人嵌合抗體CHO-K1細(xì)胞系的建立與篩選
　　將上述含抗Hantavirus mAb 3G1鼠/人嵌合重鏈和輕鏈基因表達(dá)載體的JM-109擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用紫外分光光度計(jì)定量,用脂質(zhì)體法按Lipofectamine TM 2000說明書轉(zhuǎn)染野生型CHO-K1細(xì)胞，在氨甲喋呤(MTX)和G418雙重篩選壓力下篩選穩(wěn)定、高效表達(dá)抗Hant

7、avirus嵌合抗體的細(xì)胞株，ELISA方法測定重組蛋白的表達(dá)。
　　3.抗?jié)h坦病毒鼠/人嵌合抗體的表達(dá)、鑒定及生物學(xué)活性檢測
　　擴(kuò)大培養(yǎng)上述篩選出的穩(wěn)定、高效表達(dá)嵌合抗體的細(xì)胞系，收集其培養(yǎng)上清，超濾濃縮、除鹽后，用Protein AHP Spin Trap純化試劑盒純化。純化后進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot檢測，結(jié)果表明成功表達(dá)了抗Hantavirus鼠/人嵌合抗體。通過體外中和實(shí)驗(yàn)檢測其中和活性，結(jié)果