抗人CD45抗體哺乳細胞表達載體的構(gòu)建、表達與鑒定.pdf

1、【目的】
　　構(gòu)建兩種新型抗人CD45哺乳動物細胞表達表達載體，利用DHFR系統(tǒng)篩選出能穩(wěn)定高表達抗CD45基因工程抗體的細胞株，為以人CD45為靶點的研究奠定基礎。
　　【方法】
　?。?）PCR擴增得到抗CD45抗體的輕鏈可變區(qū)VL區(qū)和重鏈可變區(qū)VH區(qū)基因，通過基因工程技術(shù)構(gòu)建抗人CD45抗體的真核表達載體，得到Anti-CD45-scFv-Fc與pBudce-CD45[H+L]。
　?。?）將兩者轉(zhuǎn)染HEK

2、-293T細胞獲得瞬時轉(zhuǎn)染表達，用Elisa方法檢測兩種真核表達載體的抗體表達量的差異。用流式細胞術(shù)檢測兩種抗體與CD45-/+細胞系的結(jié)合。
　　（3）采用抗原抗體系統(tǒng)和生物素親合素系統(tǒng)Western blot方法，鑒定抗體與CD45分子的結(jié)合特異性。
　?。?）挑選表達量較高，結(jié)合活性好以及具有結(jié)合特異性的抗體用于后續(xù)實驗研究。篩選出穩(wěn)定高表達Anti-CD45-scFv-Fc的DG44-CHO細胞株。
　　【結(jié)果

3、】
　?。?）通過分子生物學技術(shù)將抗體基因片段分別克隆至載體，得到載體Anti-CD45-scFv-Fc與pBudce-CD45[H+L]，經(jīng)測序鑒定顯示其載體DNA序列正確，表明兩種哺乳細胞表達載體均構(gòu)建成功。
　?。?）用Elisa方法檢測Anti-CD45-scFv-Fc與pBudce-CD45[H+L]兩種載體轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞后的抗體瞬時表達量分別為2mg/L和0.3mg/L。
　?。?）采用流式細胞術(shù)

4、檢測結(jié)果表明，Anti-CD45-scFv-Fc載體表達的抗體與CD45+多種細胞株（KG1a，K562，Jurkat）結(jié)合活性接近單克隆抗體，而與CD45-的多種細胞株（HepG2，A549，B16，HU）結(jié)合活性低。pBudce-CD45[H+L]載體表達量過低，因此選擇表達量高的Anti-CD45-scFv-Fc載體用于后序?qū)嶒灐?br>　?。?）Western blot鑒定結(jié)果表明Anti-CD45-scFv-Fc載體表達的抗體

5、與高表達CD45分子細胞株總蛋白在250kD處有結(jié)合條帶，符合CD45分子理論值170-250kD，而與不表達CD45分子的細胞株總蛋白在相同位置無結(jié)合條帶。同時，Anti-CD45-scFv-Fc抗體與生物素標記的人CD45（rhCD45）作用，HRP標記的親和素顯色，還原抗體與非還原抗體分別在約60kD和120 kD處有結(jié)合，符合單價抗體（包含F(xiàn)c段）與雙價抗體分子量大小，證實所構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞成功表達雙價抗體，并可與CD

6、45分子的特異性結(jié)合，達到了預計形成的抗體結(jié)構(gòu)模式。
　　（5）用DHFR系統(tǒng)篩選獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Anti-CD45-scFv-Fc的DG44-CHO細胞，并證實了該系統(tǒng)對抗體的結(jié)合活性等無明顯影響，可大量表達抗體進行后續(xù)效應實驗。
　　【結(jié)論】
　　成功改造鼠源性單克隆抗CD45抗體，構(gòu)建了表達抗人CD45抗體的哺乳細胞表達載體Anti-CD45-scFv-Fc，DHFR系統(tǒng)篩選獲得穩(wěn)定高表達Anti-CD45-scF